Óxido de grafeno - Luces del Norte de Pekín Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 21867 (2016) Citar este artículo

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Ciertas bacterias exoelectrogénicas reducen el óxido de grafeno (GO), pero sus efectos sobre el crecimiento y el metabolismo bacteriano son un tema controvertido. Este estudio tuvo como objetivo determinar si GO funciona como el aceptor de electrones terminal para permitir el crecimiento específico y la producción de electricidad por bacterias exoelectrogénicas. El cultivo de muestras ambientales con GO y acetato como único sustrato podría enriquecer específicamente las bacterias exoelectrogénicas con predominio de especies de Geobacter (51-68% de las poblaciones totales). Curiosamente, las bacterias en estos cultivos se autoagregaron en un complejo de hidrogel conductor junto con GO biológicamente reducido (rGO). Una nueva bacteria que respira GO denominada Geobacter sp. la cepa R4 se aisló de este complejo de hidrogel. Este organismo exhibió una producción de electricidad estable a >1000 μA/cm3 (a 200 mV frente a Ag/AgCl) durante más de 60 días a través de rGO mientras producía electricidad temporalmente usando fieltro de grafito. La mejor producción de electricidad depende de las características de rGO, como una gran área de superficie para el crecimiento de biopelículas, mayor capacitancia y menor resistencia interna. Este es el primer informe que demuestra el crecimiento dependiente de GO de bacterias exoelectrogénicas mientras se forma un complejo de hidrogel conductor con rGO. El proceso simple de poner y esperar que conduce a la formación de complejos de hidrogel de rGO y exoelectrógenos permitirá aplicaciones más amplias de GO a sistemas bioelectroquímicos.

Los sistemas bioelectroquímicos (BES)1 o sistemas electroquímicos microbianos (MES)2 son dispositivos de reacciones electroquímicas que utilizan microorganismos como catalizadores. Las celdas de combustible microbianas (MFC) son un representante de los BES que generan electrones para un electrodo a través de la oxidación microbiana de compuestos orgánicos3. Las bacterias exoelectrogénicas se caracterizan por su función única llamada transferencia extracelular de electrones (EET)4 y son mediadores en la producción de electricidad en los BES. Los miembros de los géneros Geobacter y Shewanella son los exoelectrógenos más estudiados que pueden transferir electrones directamente al unirse al electrodo e indirectamente a través de mediadores redox5,6.

El rendimiento de los BES se asocia principalmente con EET en biopelículas bacterianas que se desarrollan en el electrodo, pero menos con EET indirecto por células planctónicas dentro del aparato7. Por lo tanto, el material del electrodo es un determinante importante de la formación de biopelículas y el rendimiento de la transferencia de electrones en la interfaz celda-electrodo. Dado que los electrodos de carbono son químicamente estables y buenos para el desarrollo de biopelículas bacterianas, este tipo de electrodos se ha aplicado preferentemente a BESs8,9. Especialmente, el fieltro de grafito, la escobilla de carbón y la tela de carbón se han tenido en cuenta para uso práctico debido a su disponibilidad comercial, rendimiento experimental y beneficio económico. Uno de los posibles factores importantes que afectan el rendimiento de los electrodos es el área superficial. Un electrodo que tenga un área de superficie más grande puede permitir la unión de más células bacterianas que el de carbón puro o grafito10. Un avance técnico reciente en esta área de investigación es la modificación del ánodo mediante el uso de derivados de grafeno que presentan un mayor rendimiento11,12,13.

El grafeno, una red de átomos de carbono en forma de panal de una sola capa, tiene la ventaja de tener una alta conductividad y grandes áreas superficiales en diferentes órdenes de magnitud, por ejemplo, 2965 m2/g para el grafeno14 y 0,02 m2/g para el fieltro de grafito10. Sin embargo, es difícil aplicar grafeno directamente a los BES, porque es un polvo hidrofóbico y se requiere que sea un complejo con electrodos de apoyo para usar en los BES. Se ha demostrado que la adición de óxido de grafeno (GO), la forma oxidada del grafeno, a la cámara de reacción de los BES mejora la transferencia de electrones al electrodo de carbono15,16. GO en sí mismo no es eléctricamente conductor pero se convierte en conductor cuando es reducido por microorganismos17,18. Aquí esta forma reducida de GO se designa simplemente como GO reducido (rGO), porque no hay información disponible sobre su identidad química. La reducción bacteriana de GO se demostró por primera vez en cultivos de especies de Shewanella y luego en Escherichia coli19 y poblaciones mixtas complejas20. Las especies de Shewanella redujeron GO mediante el uso de proteína redox involucrada en EET17,18. Además, GO se redujo en el extracto libre de células de un cultivo de Shewanella17, posiblemente por pequeñas biomoléculas como la vitamina C21. Estos hallazgos plantean la cuestión de si GO sirve como aceptor de electrones para el acoplamiento de EET con la oxidación del sustrato en bacterias exoelectrogénicas, lo que permite su crecimiento. Hasta el momento, el crecimiento bacteriano por respiración GO aún no se ha demostrado completamente. Por otro lado, GO también ha demostrado tener actividades antibacterianas o bactericidas22,23. Estos resultados proporcionan otra suposición de que GO funciona como un simple sumidero de electrones pero no como un aceptor terminal de electrones para permitir el crecimiento respiratorio. Por lo tanto, la información sobre los efectos de GO en el crecimiento y metabolismo bacteriano es fragmentaria e indefinida en la actualidad. Esta situación ha restringido la aplicación de GO a BES.

GO tiene ventajas potencialmente mayores que el grafeno en la aplicación a BES, en parte porque GO es más económico que el grafeno y en parte porque la hidrofilia de GO puede permitir la unión de más células bacterianas a su superficie en soluciones acuosas. Si GO puede funcionar como un aceptor de electrones terminal que respalda el crecimiento de bacterias exoelectrogénicas, GO puede ser útil para el enriquecimiento selectivo de estas bacterias del medio ambiente. Además, es de gran interés notar que GO se autoagrega en un hidrogel cuando se reduce químicamente en soluciones acuosas24. Esto nos hace esperar que GO sea utilizable para la formación de un complejo de ensamblaje de alta densidad de exoelectrógenos que impulsan EET y rGO conductor.

El objetivo principal de este estudio fue determinar si el crecimiento selectivo y la autoagregación de bacterias exoelectrogénicas tienen lugar dependiendo de GO. Para este propósito, intentamos hacer cultivos de enriquecimiento de bacterias que respiran GO (GORB) del medio ambiente y examinamos estos GORB para la producción de electricidad a través de EET al electrodo. La composición filogenética de los GORB enriquecidos se determinó mediante secuenciación de alto rendimiento de amplicones del gen 16S rRNA. Como se informa en este documento, nuestros intentos de hacer un complejo de hidrogel conductor de GORB y rGO dieron resultados positivos. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en demostrar el crecimiento dependiente de GO de bacterias exoelectrogénicas acompañadas de autoagregación en un complejo de hidrogel con rGO que es capaz de producir electricidad.

Las muestras de GO utilizadas en este estudio se obtuvieron comercialmente en forma de polvo y se dispersaron en agua mediante sonicación durante 2 h. El GO preparado casi consistía en láminas de una sola capa con un grosor de 1,5 nm como se ve en las imágenes AFM y tenía abundantes picos C = O a 287 eV y un pico CC/CH a 285 eV en XPS (Fig. S1 complementaria). El área de las láminas GO fue variable con un promedio de 0,26 ± 0,46 μm.

Para enriquecer los GORB de muestras ambientales, se utilizó acetato como única fuente de carbono y energía. Los potenciales redox del acetato y un GO químicamente reducido fueron −290 mV25 y +380 mV26 frente a SHE (electrodo de hidrógeno estándar), respectivamente. La diferencia en el potencial de reducción entre los dos es termodinámicamente favorable para la generación de energía y el crecimiento resultante por el acoplamiento de reducción de GO respiratorio con oxidación de acetato.

El enriquecimiento de GORB se realizó utilizando tres muestras ambientales de agua dulce diferentes como semilla, es decir, agua de río (RW), suelo de arroz (PS) y sedimento de canal de agua (WC). Estas muestras se incubaron con GO y acetato durante varios días. Luego, se transfirieron porciones de los cultivos a medio fresco para continuar el cultivo. Mediante transferencias y cultivos repetidos de más de 10 veces, obtuvimos cultivos altamente enriquecidos designados como cultivos RW, WC y PS.

Al comienzo del proceso de enriquecimiento, el GO agregado se dispersó por completo en los cultivos, lo que resultó en suspensiones marrones (Fig. 1A). Luego, los cultivos se volvieron negros gradualmente y formaron un complejo de hidrogel denso durante un período de incubación de 10 días. Un análisis XPS mostró que GO en las tres culturas tenía espectros C1s con dos picos principales respectivos aproximadamente a 287 eV para C = O y 285 eV para enlaces CC/CH en 0 d (Fig. 1B). El pico C = O dominó inicialmente y disminuyó gradualmente con el tiempo en todos los cultivos. Mientras tanto, el pico CC/CH se volvió dominante y el pico C = O casi desapareció. Se observaron pocos o ningún cambio en la apariencia y el pico de XPS en los cultivos esterilizados en autoclave como control (Fig. 1A, B). Estas observaciones indicaron que la reducción de GO a juzgar por el cambio de color de marrón a negro depende de la actividad microbiana.

Crecimiento dependiente de GO y autoagregación de células microbianas en cultivos de enriquecimiento.

(A) Aspecto de los tres cultivos de enriquecimiento (cultivos-RW, -PS, -WC) inoculados con células esterilizadas en autoclave e intactas, que muestran la formación de un complejo de hidrogel autoagregado. (B) Datos XPS de GO y el GO parcialmente reducido en los cultivos con inóculos esterilizados en autoclave o intactos después de 10 días. (C) Concentración de acetato en los cultivos con y sin GO después de 10 días. (D) Densidad celular en los cultivos con y sin GO y acetato (ACE) después de 10 días.

En los tres cultivos de enriquecimiento, se consumió acetato junto con la reducción de GO pero permaneció sin cambios en el control sin GO (Fig. 1C). La disminución simultánea en la intensidad del pico C = O y la concentración de acetato sugirieron que la reducción de GO junto con la oxidación del acetato. Cuando el complejo de hidrogel se dispersó en la fase acuosa mediante homogeneización, la densidad celular fue aproximadamente 20 veces mayor en los cultivos modificados con GO y acetato que en los cultivos sin aditivo o ambos, lo que representa (4,0–7,6) × 106 células/mL (Fig. 1D). Dado el hecho de que las bacterias presentes requerían tanto GO como acetato para su crecimiento, es lógico concluir que este crecimiento en realidad depende de la respiración anaeróbica con GO como aceptor terminal de electrones y acetato como fuente de carbono y energía.

En los cultivos de enriquecimiento con GO, el 80 ± 12% de las células se distribuyeron en el complejo de hidrogel desarrollado (Tabla 1). Las imágenes SEM del complejo de hidrogel revelaron que la inclusión de estructuras celulares bacterianas se produjo en la superficie del complejo (Fig. 2). Los morfotipos de bacterias en los tres cultivos fueron similares entre sí, ya que abundaron los bastoncillos curvos y ocasionalmente se observaron cocos. Estas estructuras celulares no se observaron en GO antes de la incubación.

Imágenes SEM de GO y los complejos rGO-GORBs.

(A) Imagen SEM de GO utilizada en este estudio. (B–D) Imágenes SEM de los complejos rGO-RGOBs en cultivo-RW (B), -PS (C), -WC (D), respectivamente.

Para identificar bacterias en los complejos de hidrogel negro de rGO y GORB, los genes de ARNr 16S de estos complejos se amplificaron mediante PCR y se analizaron mediante secuenciación de alto rendimiento con la plataforma Illumina MiSeq. En los tres cultivos, los genes 16S rRNA de especies de Geobacter, bacterias exoelectrogénicas bien conocidas, fueron los más abundantes y representaron el 51–68 % del total de amplicones (Fig. 3). Además de la bacteria Geobacter, se detectaron significativamente miembros de Azospira en los tres cultivos, que comprenden entre el 28% y el 42% de la población total. Las especies de Azospira, que son oxidantes de acetato, se han detectado con frecuencia en la cámara anódica de las MFC27,28.

Identificación de bacterias cultivadas con GO.

Los gráficos circulares de identificación filogenética de unidades taxonómicas operativas (OTU) en tres culturas (cultura-RW, -PS, –WC). Las OTU que tienen más del 1% de frecuencia se muestran en los gráficos.

Como se señaló anteriormente, obtuvimos con éxito los complejos de hidrogel rGO-GORB a través del proceso de enriquecimiento con GO y acetato. Para garantizar la capacidad de estos complejos para convertir acetato en electricidad, se polarizaron a +200 mV (frente a Ag/AgCl). La electricidad en los tres complejos se generó rápidamente y el nivel máximo apareció en un rango de 1000 a 1300 μA/cm3 en los días 1 y 2 (Fig. 4A). La producción de electricidad disminuyó gradualmente con el tiempo, pero se recuperó al agregar acetato. La producción inmediata y estable de electricidad se debió al crecimiento significativo y la actividad estable de los exoelectrógenos reductores de GO en los complejos después de la polarización. Después de 10 a 20 días de polarización con la adición triple de acetato 5,0 mM, los recuentos celulares totales en los tres cultivos variaron de (3,7 a 4,9) × 109 a (0,53 a 3,8) × 1012 células/cultivo (Tabla 1) y 64–89% estaban presentes dentro de los complejos. La densidad celular por unidad de volumen fue 160 veces mayor (0,5 × 1011 a 3,1 × 1011 células/cm3) en los complejos que en la fase líquida con células planctónicas (1,7 × 108 a 5,3 × 108 células/mL). En todos los complejos, las especies de Geobacter constituyeron una mayoría abrumadora (77–91%) de las poblaciones cultivadas electroquímicamente (Tabla complementaria S1).

Producción de electricidad por los complejos rGO-GORBs.

(A) Cambios en la electricidad producida por los complejos rGO-GORBs inoculados con RW, PS y WC. (B) CV obtenido por los tres complejos rGO-GORBs. (C) EIS obtenido por los tres complejos rGO-GORBs. Los números que se muestran en el gráfico son frecuencias: f [Hz] = ω/2π.

Las curvas de CV para los tres complejos rGO-GORB mostraron la corriente catalítica de oxidación de acetato, por ejemplo, 1200–1700 μA/cm3 a 500 mV frente a Ag/AgCl con 0,2 mV/s de velocidad de exploración (Fig. 4B). No apareció ningún pico redox obvio. Los voltamogramas para los cultivos RW y PS mostraron descargas de corriente simétricas infladas, lo que indica que la capacitancia de la doble capa eléctrica dependía de la gran área superficial de los complejos rGO-GORB. En la cultura WC, la curva CV se sesgó a potenciales más bajos. Sobre la base del diagrama de Nyquist utilizando datos sin procesar para los tres complejos (Fig. 4C), las resistencias de transferencia de carga (Rct), expresadas como el diámetro de los semicírculos, fueron <1,0 Ω/cm3 en cultivos RW y PS y 1,0–2,0 Ω/cm3 en cultivo WC. Los dos semicírculos aparentes en WC indicaron que estaban involucradas dos reacciones electroquímicas. El semicírculo más pequeño fue similar a los observados en los cultivos RW y PS, lo que sugiere que tuvo lugar una reacción cinética electroquímica de Geobacter. El semicírculo más grande posiblemente mostró la participación de reacciones cinéticas electroquímicas por parte de otras bacterias, como las especies de Sulfurospirillum, ciertamente cultivadas en WC (13 % de la población total), pero no o menos cultivadas (<0,1 %) en RW y PS (Tabla complementaria S1).

Para determinar si las bacterias Geobacter enriquecidas son realmente capaces de crecer mediante respiración GO, se realizaron intentos de aislar Geobacter de los cultivos enriquecidos mediante cultivo de agar anaeróbico con GO. Como resultados, el cultivo RW arrojó pequeñas colonias con un gran halo negro en el medio de agar como positivas para la reducción de GO (Fig. 5A). Una única colonia de esta placa de agar se purificó con éxito mediante diluciones repetidas en agar y se diseñó como cepa R4. Mediante la secuenciación del gen 16S rRNA, la cepa R4 se identificó en realidad como un miembro del género Geobacter con la cepa Df1T de Geobacter bremensis (número de acceso U96917) como su pariente más cercano con un nivel de similitud del 99,3 %.

Crecimiento dependiente de GO y autoagregación de Geobacter sp. cepa de células R4.

(A) La formación de halo negro por la cepa R4 en una placa de agar es positiva para la reducción de GO. (B) Reducción de GO y autoagregación de células en un complejo de hidrogel en los cultivos R4 inoculados con inóculos intactos (superior) y esterilizados en autoclave (inferior). (C) Datos XPS de espectros C1s en el cultivo R4 intacto. (D) Concentración de acetato en los cultivos R4 intactos con y sin GO. (E) El número de copias del gen 16S rRNA en los cultivos R4 intactos con y sin GO y acetato (ACE).

Un cultivo puro de Geobacter sp. la cepa R4 fue capaz de reducir GO y formar un complejo de hidrogel negro con rGO (complejo rGO-R4) similar al observado en el cultivo RW (Fig. 5B, C). La cepa R4 requirió 30 días para formar el complejo rGO-R4, mientras que tomó 10 días para formar el complejo rGO-RW en el cultivo mixto. El crecimiento anaeróbico de la cepa R4 se produjo junto con el consumo de acetato y la reducción de GO (Fig. 5D, E). En un análisis XPS de tres muestras tomadas de diferentes posiciones del complejo el día 36, se observaron repetidamente los abundantes enlaces CC como pico principal de C1 (Figura complementaria S2), lo que sugiere que GO en el complejo se redujo por completo. La conductividad eléctrica del complejo rGO-R4 fue de 16 mS/cm, que es mucho más alta que la registrada para el GO original a través de la reducción microbiana (Figura complementaria S3A,B).

Estos resultados muestran que Geobacter sp. la cepa R4 es capaz de crecer anaeróbicamente por respiración GO sin ninguna asociación con otros microorganismos y formar un hidrogel conductor con rGO.

El complejo rGO-R4 fue examinado por su capacidad para producir electricidad. A modo de comparación, se utilizó fieltro de grafito (GF), un ánodo representativo ampliamente utilizado en MFC. En ambos sistemas complejos, el número de células presentes fue de aproximadamente 8,0 × 108 células/complejo. Las células de la cepa R4 produjeron electricidad en ambos complejos a 1300-1700 μA/cm3 en 7 días, pero exhibieron diferentes perfiles de producción según los ánodos utilizados (Fig. 6A). La electricidad en el complejo GF-R4 se redujo gradualmente con el tiempo y no se recuperó agregando acetato, mientras que la electricidad en el complejo rGO-R4 se generó de manera estable. Estos resultados se reprodujeron altamente en ensayos repetidos, como se muestra en la Fig. S2 complementaria. La concentración de acetato en el cultivo de rGO-R4 se volvió inferior al límite de detección después de 20 días de incubación. Por otro lado, más de la mitad del acetato agregado (8,0 mM) aún permanecía en el cultivo GF-R4 (Figura complementaria S4). Estos resultados indican que el cultivo rGO-R4 puede oxidar acetato y generar electricidad mucho más eficientemente que el cultivo GF-R4.

Producción de electricidad por Geobacter sp. colar R4 usando GO y fieltro de grafito como ánodo.

(A) Cambios en la electricidad en los complejos rGO-R4 (verde) y GF-R4 (morado). (B) Aspecto de los complejos rGO-R4 y GF-R4 tras 30 días de incubación. (C) Imagen SEM de los complejos rGO-R4 y GF-R4 después de 30 días de incubación. (D) Curvas CV obtenidas por los complejos rGO-R4 y GF-R4. (E) Datos EIS obtenidos por los complejos rGO-R4 y GF-R4. El recuadro muestra los mismos datos ampliados en un rango estrecho. Los números que se muestran en el gráfico son frecuencias: f [Hz] = ω/2π.

Los complejos rGO-R4 se volvieron rosados después de una semana de polarización (Fig. 6B). Esta coloración dependiente del tiempo fue similar a la que se ve típicamente en la biopelícula multicapa de Geobacter. La densidad de células en el complejo rGO-R4 cambió de 8,0 × 108 células/cm3 a 3,6 × 1010 células/cm3, lo que representa el 93 % de la población total en todo el cultivo (Tabla 2). La observación SEM indicó que la superficie del complejo rGO-R4 estaba efectivamente cubierta con abundantes células (Fig. 6C). Todos estos resultados sugirieron la formación de biopelícula multicapa en el complejo rGO-R4 por polarización eléctrica. Por el contrario, en el cultivo de GF-R4, no se desarrolló biopelícula aparente pero se formó una fase líquida rosa turbia (Fig. 6B). La masa total de células en el cultivo GF-R4 no fue más del 6,4 % de la del cultivo rGO-R4 (Tabla 2) y el 64 % de las células eran planctónicas. Este nivel más bajo de biomasa podría estar relacionado con los perfiles electroquímicos y fisiológicos en el cultivo GF-R4.

Para evaluar el efecto de la estructura de hidrogel del complejo rGO-R4 en la producción de electricidad, la cepa R4 se cultivó eléctricamente utilizando grafito recubierto con o sin GO (Figuras complementarias S5 y S6). En ambos cultivos, la cepa R4 formó biopelículas en la superficie del grafito (Tabla complementaria S3) y produjo electricidad. Sin embargo, a diferencia del caso del complejo de hidrogel, la producción de electricidad en ambas culturas disminuyó gradualmente con el tiempo. Estos resultados indican que la estructura del hidrogel es importante para mantener la producción de electricidad por parte de la cepa R4.

El análisis CV del complejo rGO-R4 después de la polarización mostró una corriente catalítica mucho mayor (1300 μA/cm3) en el complejo rGO-R4 a 500 mV (vs Ag/AgCl) que en el complejo GF-R4 (470 μA/cm3 ) (Fig. 6D). La mayor producción de electricidad con rGO probablemente se debió a una mayor capacitancia y una resistencia mucho menor que las observadas con GF (Fig. 6E). Los datos de EIS mostraron claramente un Rct 10 veces más pequeño en el complejo rGO-R4 que en el complejo GF-R4, es decir, <1,0 Ω/cm3 y >10 Ω/cm3, respectivamente. En reacciones cinéticas electroquímicas ideales, la capacitancia (C) es inversamente proporcional a Rct y la frecuencia angular (ωmax) que muestra la parte superior del semicírculo (ωmaxCRct = 1). Por lo tanto, se puede estimar que la capacitancia en rGO-R4 es mayor que la de GF-R4.

También se observó un mejor rendimiento del complejo rGO-R4 incluso antes de la polarización eléctrica (Figura complementaria S7). Los resultados indicaron claramente que el complejo rGO-R4 originalmente tenía una capacitancia eléctrica de doble capa y una pequeña resistencia a la transferencia de carga antes de la formación de la biopelícula. La biopelícula formada en el complejo después de la polarización mostró una conductividad eléctrica de 0,46 mS/cm, que es mucho menor que el valor del complejo rGO (16 mS/cm). Estos resultados indicaron que la mayor capacitancia eléctrica y la menor resistencia a la transferencia de carga procedían del complejo de hidrogel en sí mismo en lugar de la biopelícula en el complejo, aunque potencialmente respaldada en parte por la biopelícula.

Aunque GO es un nanomaterial que tiene una gran promesa en la aplicación de BES, ha estado en disputa en relación con sus efectos sobre el crecimiento y el metabolismo bacteriano. Durante la última década, una serie de estudios han demostrado que GO tiene efectos antibacterianos o bactericidas en una amplia variedad de especies22,23,29,30. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue determinar si GO funciona como el aceptor de electrones terminal para apoyar el crecimiento de bacterias exoelectrogénicas y nuestro intento de demostrar esto fue exitoso. El crecimiento dependiente de GO permitió el enriquecimiento selectivo de bacterias exoelectrogénicas en el complejo (Figs. 1 y 3). El uso de este proceso tiene una mayor ventaja para reducir GO que otras técnicas de reducción de GO abióticos. Los resultados inconsistentes de los estudios previos que muestran actividad antibacteriana y los nuestros probablemente surjan de las diferencias en las condiciones experimentales con la configuración de GO. Artículos recientes han indicado que la actividad antibacteriana de GO es detectable solo en la superficie recubierta con GO de tamaño pequeño pero no en la solución acuosa31,32. Por lo tanto, el crecimiento de bacterias exoelectrogénicas que encontramos puede ser inducido por el estado no citotóxico de GO en solución acuosa31.

Una de las observaciones más llamativas de este estudio es que el cultivo de muestras ambientales resultó en la formación de complejos de hidrogel autoagregados de bacterias exoelectrogénicas y rGO que pueden funcionar como conductores. El mecanismo de esta formación de hidrogel se desconoce con certeza, pero esto posiblemente se deba al apilamiento parcial π-π del rGO, como se observó previamente en la reducción hidrotermal de GO al hidrogel rGO24. Por lo tanto, la formación de hidrogel rGO probablemente depende de la capacidad bacteriana para reducir GO. Cuando las especies de Shewanella17,18 y Escherichia coli19 se cultivaron con GO, el rGO resultante estaba presente como flóculos pero no como un complejo de hidrogel. Sin embargo, estas especies bacterianas pueden formar el hidrogel rGO en las mismas condiciones culturales que se utilizan en este estudio. Por lo tanto, el presente estudio proporciona un nuevo modelo de bioconductores como un ensamblaje de alta densidad de rGO y bacterias.

Como se informa en este documento, las poblaciones de Geobacter enriquecidas con GO del medio ambiente en los complejos de hidrogel son mucho más altas que las detectadas en entornos naturales como suelo de arroz33, sedimentos de humedales34 y sedimentos de acuíferos35. También vale la pena señalar que los complejos rGO-GORB incluían poblaciones de Geobacter más altas que las MFC alimentadas con acetato, donde Geobacter constituía entre el 14% y el 60% de la población total36,37,38,39. Esto sugiere que el cultivo con GO es más útil para el enriquecimiento selectivo de Geobacter y otras bacterias impulsoras de EET en comparación con el sistema convencional bajo polarización eléctrica. Además de las especies de Geobacter, se detectaron miembros de Azospira en proporciones significativas (28-41% en total) en los cultivos de enriquecimiento. Aunque las especies de Azospira se han detectado con frecuencia en MFC27,28, no se ha informado que ninguna de ellas reduzca los aceptores de electrones extracelulares. Uno de los rasgos característicos de las bacterias impulsoras de EET, como las especies Geobacter y Shewanella40, es la capacidad de oxidar sustancias húmicas y, de manera similar, se ha informado que una cepa de Azospira oxida sustancias húmicas41. Sobre la base de estos resultados colectivos, se puede suponer que las bacterias Azospira en los complejos rGO-GORB están involucradas en la reducción de GO. En cultivo WC, la proporción de Sulfurospirillum aumentó de 6,1% a 13% por polarización. En vista de esto, junto con el hecho de que los miembros de Sulfurospirillum son capaces de convertir EET en óxidos de hierro42, estas bacterias pueden desempeñar un papel en la producción de electricidad en el complejo rGO-GORB.

Geobacter sp. la cepa R4, una bacteria recién aislada en este estudio, exhibió un crecimiento de biopelículas y una producción de electricidad estable con rGO mientras mostraba un crecimiento planctónico y una producción de electricidad temporal con GF (Fig. 6). Esta diferencia en las características bioelectroquímicas entre los dos cultivos sugiere que la cepa R4 cambia el modo de EET dependiendo de los materiales de carbono, es decir, EET directo a rGO y EET indirecto a GF a través de moléculas redox acuosas. Se ha demostrado que, en las especies exoelectrogénicas de Geobacter, los EET directos son catalizados por proteínas de la membrana externa, incluidos los citocromos de tipo c y el biofilamento conductor. El crecimiento de células planctónicas de Shewanella oneidensis43 bajo polarización se asocia para producir lanzaderas de electrones como las flavinas44. Es notable que el cambio dependiente de electrodos del modo EET por un cultivo puro se encontró por primera vez en este estudio. Las características únicas de Geobacter sp. La cepa R4 proporcionará una nueva visión de la comprensión integral de la interacción de las bacterias exoelectrogénicas con el electrodo de carbono.

Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en demostrar el crecimiento selectivo dependiente de GO de bacterias exoelectrogénicas y la formación de un complejo de hidrogel autoagregado de biomasa y rGO. El complejo rGO-GORB tiene un mejor crecimiento de biopelículas, una resistencia interna mucho más pequeña y una capacitancia más grande que el sistema usado con GF. El simple proceso de poner y esperar que conduce a la autoagregación en el complejo rGO-biomasa y la mejora de EET entre las bacterias y el electrodo contribuirá a la expansión de la aplicación de GO en BES.

El polvo GO se compró a Royal Elite New Energy Science & Technology Co., Ltd (Shanghai, China). GO se disolvió en agua MilliQ esterilizada para dar una concentración de 10 g/L, se sonicó durante más de 2 h con un sonicador Bransonic modelo CPX (Branson Ultrasonics, Emerson Japan, Ltd., Atsugi, Japón) y se almacenó a 4 °C hasta usar. El GO así preparado se analizó en cuanto a espesor y área de escamas con un microscopio de fuerza atómica Agilent PicoPlus 5500 (Agilent Tech. Inc., Santa Clara, CA).

Los estados químicos de GO y GO biológicamente reducido (rGO) se analizaron mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). Para este análisis, el GO y el rGO se depositaron y secaron en una oblea de silicio. Las obleas de silicio se recogieron, se lavaron varias veces con agua MilliQ y se secaron como se describió anteriormente17. Los espectros XPS se midieron con un instrumento XPS, Versa Probe PHI-5000 (ULVAC-PHI Inc., Osaka, Japón) equipado con una fuente monocromática de rayos X Al Ka y operado a una presión desnuda inferior a 10−6 Pa. El núcleo El espectro de nivel de C1s se obtuvo a través de exploraciones enfocadas después de la exploración de la encuesta sobre 0–1,100 eV.

Los GORB se enriquecieron mediante el cultivo anaeróbico de muestras ambientales utilizando un medio químicamente definido con acetato como fuente de carbono y energía y GO como aceptor de electrones. Como semilla, usamos tres muestras ambientales diferentes, es decir, agua de río (RW diseñado, 34°42′22″N, 137°23′31″E), sedimento en un canal de agua (WC diseñado, 34°42′26 ″N, 137°23′42″E) y un suelo de arrozal (PS diseñado, 34°42′37″N, 137°23′47″E). Los tres cultivos RW, WC y PS se incubaron de forma independiente y se transfirieron secuencialmente a medio fresco periódicamente como se describe en la información de apoyo. Posteriormente al enriquecimiento, los GORB de los cultivos de enriquecimiento se aislaron mediante la técnica de dilución en agar como se describe en la información de respaldo.

Los GORB enriquecidos y aislados se identificaron filogenéticamente mediante la secuenciación de genes de ARNr 16S. Los genes de ARNr 16S de los cultivos de enriquecimiento se amplificaron por PCR con el ADN a granel como plantilla y se secuenciaron con el sistema Illumina MiSeq, como se describe en la información de respaldo. Un aislado de GORB del cultivo de enriquecimiento se sometió a amplificación por PCR del gen 16S rRNA utilizando los cebadores 27f y 1492r (tabla de apoyo 1). El amplicón del gen 16S rRNA se secuenció usando un kit Applied Biosystems Big Dye Terminator V3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) y un Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Life Technologies) como se describió anteriormente45.

Para la cuantificación de acetato en el cultivo, se tomó una parte del cultivo y se analizó mediante un sistema HPLC de fase inversa (Shimadzu, Kyoto, Japón) equipado con L-column2 ODS (4,6 × 250 mm) (CERI, Tokio, Japón) y un detector UV como se describió anteriormente46. Los recuentos directos de células totales en los cultivos de enriquecimiento, RW, PS y WC se determinaron mediante microscopía de epifluorescencia con tinción SYBR GREEN II47. Para monitorear el crecimiento celular en un cultivo puro de la cepa R4, se realizó qPCR en tiempo real usando un conjunto de cebadores universales para los genes bacterianos 16S rRNA, 357f y 517r (Tabla complementaria S2). La qPCR se realizó con un kit LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) y el sistema LightCycler Nano (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) como se describió anteriormente45. Como estándar, se usó el amplicón del gen 16S rRNA purificado del ADN genómico de la cepa R4.

Para los ensayos de producción de electricidad microbiana en los complejos rGO-GORB, se incubaron cultivos puros y enriquecidos de GORB en una botella de vidrio de 0,93 L de capacidad (tamaño, 90 mm de diámetro y 175 mm de altura) con las siguientes modificaciones menores. Para el complejo inoculado con cultivos de enriquecimiento, se preparó 1 L de medio mineral anaerobio denominado AGOFS en una botella de vidrio de 2 L y se autoclavó (ver información complementaria). Para el complejo rGO-R4, también se preparó medio AGOSF. Después de esterilizar en autoclave, el medio se mezcló con 0,67 g/l de GO y 15 ml del precultivo y se cargó en una botella de vidrio para eliminar el espacio de cabeza. A continuación, la botella de vidrio se incubó a 28 °C durante 1 mes. Después de la incubación, se obtuvo un complejo de hidrogel de aproximadamente 30 mm de diámetro y 10-20 mm de altura.

Para las imágenes SEM, el complejo rGO-GORBs se fijó con glutaraldehído al 2 % y tetróxido de osmio al 1 % como se describe en la información de apoyo. Las muestras preparadas se recubrieron con oro y luego se observaron bajo un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo SU8000 (Hitachi Co., Ltd., Tokio, Japón) que operaba a 1,0 kV.

Para el cultivo electroquímico se utilizó una botella de vidrio esterilizada de 0,93 L de capacidad (90 mm de diámetro y 175 mm de altura) conectada con un alambre de platino como electrodo de trabajo. La botella se llenó con medio AGOS (ver información de respaldo) al que se agregaron los complejos rGO-GORB. A modo de comparación, se utilizó GF con 30 mm de diámetro y 20 mm de espesor como ánodo MFC representativo. El GF se sumergió en la suspensión celular de R4 y las células que contenían GF se usaron como el complejo GF-R4. Se utilizó un electrodo de Ag/AgCl (sal de KCl) y otro alambre de platino como electrodo de referencia y contraelectrodo, respectivamente. La polarización se realizó ajustando el potencial del electrodo de trabajo a +200 mV frente a Ag/AgCl utilizando un potenciostato HA-1510 (Hokuto Denko, Tokio, Japón). Durante la polarización, se registró la corriente cada 60 min utilizando un registrador de datos (T&D Corporation, Nagano, Japón).

El análisis de voltamperometría cíclica (CV) y la espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) de los complejos rGO-GORB se realizaron utilizando un sistema de medición electroquímica HZ-7000 (Hokuto Denko, Tokio, Japón). Los análisis de CV y EIS se realizaron utilizando la misma botella que la utilizada para el cultivo electroquímico descrito anteriormente después de 2 h de estabilización con acetato 5,0 mM. La CV se realizó a una velocidad de exploración de 0,2 mV/s, en el rango de potencial de -400 a 600 mV (frente a Ag/AgCl). Se examinó EIS para los complejos rGO-GORB en un rango de frecuencia de 100 kHz−0,5 mHz a 200 mV con una amplitud de 20 mV para la señal de CA aplicada. Los gráficos de Nyquist se analizaron usando un software de análisis de datos EIS ZSimpWin (Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN). Los análisis de CV y EIS se realizaron a los 10 días de polarización para los complejos de cultivos RW y PS, mientras que a los 20 días para el complejo de cultivos WC. Para los complejos con la cepa R4, los datos se obtuvieron en 7d y 12d de polarización de los complejos rGO y GF de run2 (Fig. S2 complementaria).

La secuencia del gen 16S rRNA de la cepa R4 determinada en este estudio se ha depositado con el número de acceso DDBJ LC076693 (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html). Se depositó un conjunto compilado de las secuencias de Illumina MiSeq en la base de datos Short Read Archive con el número de registro DRA003954.

Cómo citar este artículo: Yoshida, N. et al. Crecimiento dependiente de óxido de grafeno y autoagregación en un complejo de hidrogel de bacterias exoelectrogénicas. ciencia Rep. 6, 21867; doi: 10.1038/srep21867 (2016).

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Este estudio recibió fondos de JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (número de subvención: 26701010); el Programa de Difusión del Sistema de Seguimiento de la Tenencia, MEXT, Japón; y el Programa de Aceleración de la Utilización de Propiedad Intelectual Universitaria de JST.

Centro para el Fomento de Investigadores Jóvenes e Innovadores, Instituto de Tecnología de Nagoya, Nagoya, Aichi, 466-8555, Japón

naoko yoshida

Instituto de Investigación Interdisciplinario Inspirado en la Electrónica (EIIRIS), Universidad Tecnológica de Toyohashi, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japón

Naoko Yoshida, Yuko Goto, Ryugo Tero y Akira Hiraishi

Instituto Municipal de Investigación Industrial de Nagoya, Nagoya, 456-0058, Aichi, Japón

Yasushi Miyata

Departamento de Ingeniería Civil, Instituto de Tecnología de Nagoya, Nagoya, 466-8555, Aichi, Japón

kasumi-doi

Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Vida y la Salud, Universidad de Chubu, Kasugai, 487-8501, Aichi, Japón

yuko goto

Departamento de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad Tecnológica de Toyohashi, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japón

Yuji Nagao, Ryugo Tero y Akira Hiraishi

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NY diseñó el estudio, escribió el manuscrito y realizó experimentos de enriquecimiento, preparación del complejo rGO-GORB y cultivo electroquímico. YN y YG participaron en experimentos de enriquecimiento. KD participó en el cultivo electroquímico de la cepa R4. RT realizó análisis de GO y rGO y participó en la revisión del manuscrito. YM realizó experimentos CV y EIS. AH participó en la interpretación de datos y revisó el manuscrito.

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Yoshida, N., Miyata, Y., Doi, K. et al. Crecimiento dependiente de óxido de grafeno y autoagregación en un complejo de hidrogel de bacterias exoelectrogénicas. Informe científico 6, 21867 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21867

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Recibido: 09 Octubre 2015

Aceptado: 02 febrero 2016

Publicado: 22 febrero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21867

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