La resistencia al inhibidor mutante de la isocitrato deshidrogenasa 1 ivosidenib se puede superar con un dímero alternativo

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4785 (2022) Citar este artículo

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Ivosidenib, un inhibidor de las variantes R132C y R132H de isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), está aprobado para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA). Ha surgido resistencia a ivosidenib debido a una mutación en el segundo sitio de IDH1 R132C, que conduce a IDH1 R132C/S280F. Describimos estudios bioquímicos, cristalográficos y celulares sobre las variantes IDH1 R132C/S280F y R132H/S280F que informan sobre el mecanismo de resistencia en el segundo sitio, que implica tanto la modulación de la unión del inhibidor en la interfaz del dímero IDH1 como la alteración de las propiedades cinéticas. que permiten una producción de 2-HG más eficiente en relación con IDH1 R132C e IDH1 R132H. Es importante destacar que los resultados bioquímicos y celulares demuestran que debería ser posible superar la resistencia mediada por S280F en pacientes con AML mediante el uso de inhibidores alternativos, incluidos algunos actualmente en ensayos clínicos de fase 2.

Durante mucho tiempo se ha sabido que las células cancerosas tienen el potencial de alterar el metabolismo1, pero solo recientemente se ha explotado este conocimiento con fines terapéuticos1,2,3. En los seres humanos, hay tres isoformas de isocitrato deshidrogenasa (IDH1-3), que catalizan la conversión de isocitrato en 2-oxoglutarato (2-OG); IDH1/2 emplea NADP+ como cofactor, mientras que IDH3, que forma parte del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), utiliza NAD+4,5. Varias mutaciones somáticas en los genes que codifican para la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) y 2 (IDH2) conducen a variantes con una capacidad sustancialmente mayor para catalizar la reducción de 2-OG a 2-hidroxiglutarato (2-HG)6,7,8,9. En consecuencia, se proponen niveles elevados de 2-HG para promover la tumorigénesis, potencialmente a través de la desestabilización de la cromatina10. Las variantes de IDH1 más comunes en las células cancerosas son R132H y R132C11.

Se han informado múltiples inhibidores de IDH1 e IDH2, aunque solo un inhibidor de IDH1 (ivosidenib) y un inhibidor de IDH2 (enasidenib) han sido aprobados para uso clínico, es decir, para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (AML) donde las células cancerosas producen una variante de IDH12,13. Sin embargo, la resistencia a ivosidenib ha surgido como consecuencia de una mutación de segundo sitio que produce IDH1 R132C/S280F, habiéndose notificado hasta la fecha 5 casos14,15,16.

La base mecánica precisa por la cual la sustitución del segundo sitio IDH1 S280F permite la resistencia a ivosidenib y sus consecuencias para la inhibición de la variante IDH1 más allá de la de ivosidenib no han sido claras14,15,16. Presentamos estudios bioquímicos, estructurales y celulares sobre IDH1 R132C/S280F e IDH1 R132H/S280F que abordan estas cuestiones. Los resultados con enzimas aisladas informan sobre el mecanismo de la resistencia mediada por S280F, que implica la reducción de la unión del inhibidor en la interfaz del dímero y la alteración de las propiedades cinéticas, lo que permite una mayor producción de 2-HG en relación con IDH1 R132C o R132H. Es importante destacar que los resultados revelan que la sustitución S280F provoca resistencia a ivosidenib, pero este no es el caso con varios otros inhibidores de IDH1 R132H y R132C, algunos de los cuales se encuentran en ensayos clínicos de fase 2.

Para investigar el mecanismo de la resistencia al inhibidor mediada por IDH1 S280F, utilizamos protocolos establecidos17,18 para producir formas altamente purificadas de IDH1 R132C/S280F y R132H/S280F recombinantes y, a modo de comparación, IDH1 R132C, IDH1 R132H, IDH1 de tipo salvaje (wt), IDH1 S280F (sin IDH1 R132C o R132H) e IDH1 R132H/Q277E (Fig. 1a complementaria). La variante IDH1 R132H/Q277E se elaboró porque la resistencia farmacológica adquirida contra el inhibidor mutante IDH2 enasidenib se ha relacionado con (i) IDH2 R140Q/I319M y (ii) IDH2 R140Q/Q316E; IDH2 I319 es homólogo a IDH1 S280 e IDH2 Q316 es homólogo a IDH1 Q277 (Fig. 1b / c complementaria) 14. De acuerdo con estudios previos sobre IDH1 R132H y R132C, todas las proteínas recombinantes eran predominantemente diméricas en solución (Fig. 1d-f complementaria) y probablemente se copurifican con dos moléculas de NADPH (como se informó para IDH1 wt y R132H18, y se muestra para IDH1 R132C, Complementaria). figura 1g/h). Si bien los estudios biofísicos muestran que la sustitución S280F no afecta la estructura secundaria (Fig. 1i complementaria), esta sustitución mejora sustancialmente la estabilidad termodinámica de las variantes IDH1 R132C y R132H, así como IDH1 wt (Fig. 1b; Fig. 1j complementaria) ). Tenga en cuenta que en el texto siguiente, todas las variantes de IDH a las que se hace referencia están basadas en IDH1, excepto donde se indique lo contrario.

una variante de IDH1 catalizó la oxidación de isocitrato y la reducción de 2-OG a 2-HG. b Parámetros cinéticos para variantes de IDH1 (400 nM) de ajustes de curva de regresión no lineal (error estándar de la media, n = 3). Condiciones: Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 0,005 % v/v y BSA 0,1 mg/ml (pH 8,0). Sombreado: temperaturas de fusión (Tms) de las variantes de IDH1 medidas por fluorimetría diferencial de barrido (DSF, enzima 3 µM) o dicroísmo circular (CD, enzima 0,2 mg/ml); λ: 215 nm. Condiciones: DSF (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4); CD (fosfato de sodio 10 mM, pH 8,0). Consulte la información complementaria para obtener más detalles. c Formación de 2-HG a partir de 2-OG catalizada por variantes de IDH1 medida por RMN de 1H (700 MHz; barras de error: errores estándar de la media, n = 3 réplicas independientes de experimentos de curso de tiempo de 1H). Condiciones: enzima 500 nM, MgCl2 10 mM, 2-OG 1,5 mM, NADPH 1,5 mM; tiempo de incubación: 12 min. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Formación de 2-HG a partir de isocitrato catalizada por variantes de IDH1 medida por RMN (700 MHz; error estándar de la media, n = 3 réplicas independientes de experimentos de evolución temporal de 1H). Condiciones: enzima 750 nM, MgCl2 10 mM, isocitrato de DL 3 mM, NADP+ 1,5 mM; tiempo de incubación: 9 min. Tampón: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10 %, pH 7,5. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Analizamos las actividades catalíticas de las variantes R132C/S280F y R132H/S280F, empleando 1H NMR para medir la reducción de 2-OG a 2-HG y la conversión de isocitrato en dos etapas a 2-HG (Fig. 1a/c/ d, Fig. 2a/b complementaria). Debido a la naturaleza redox neutral general de las dos reacciones involucradas en la conversión de isocitrato en 2-HG, esta conversión no puede monitorearse fácilmente mediante mediciones de NADP+/NADPH18. Como se anticipó, los resultados de RMN muestran que el D-isocitrato es un sustrato para R132C/S280F y R132H/S280F (Fig. 2c complementaria). En particular, revelan que tanto el R132C/S280F como el R132H/S280F catalizan la conversión de isocitrato en 2-HG y de 2-OG en 2-HG de manera más eficiente que el R132C o el R132H, respectivamente. (Figura 1c/d)

Los análisis cinéticos con R132C/S280F y R132H/S280F que monitorean el consumo de NADPH por espectroscopia UV (Fig. 1b) demostraron que la sustitución de S280F aumenta la eficiencia catalítica (medida por kcat/KM) para la conversión de 2-OG a 2-HG, en comparación a las variantes análogas R132C y R132H, con valores de KM disminuidos tanto para 2-OG como para Mg2+. En contraste con estas variantes, la variante R132H / Q277E, que es predominantemente dimérica y que tiene una estructura secundaria similar en comparación con las otras variantes de IDH estudiadas (Figura complementaria 1d-f, i), fue inactiva por ensayos de RMN 1H (Figura complementaria Fig. 2d/e) y es menos estable que el R132H (Fig. 1j complementaria; Fig. 1b). Los estudios de fluorimetría de barrido diferencial (DSF) que utilizan N-oxalilglicina (NOG) como un análogo de 2-OG catalíticamente inactivo19,20 e isocitrato (con Mg2+ 10 mM), indican que R132H/Q277E no se une, al menos de manera eficiente, a NOG o isocitrato , probablemente reflejando su inactividad (Fig. 2f complementaria).

Los análisis cinéticos que miden el consumo de NADP+ para la variante S280F (sin las sustituciones R132C o R132H) para la conversión de isocitrato en 2-OG (Tabla complementaria 1a) muestran una mayor eficiencia (kcat/KM) en comparación con el peso de IDH1 como resultado de una disminución de KM para isocitrato; no hubo cambio en la KM aparente para Mg2+. Sin embargo, con la variante IDH1 S280F, los valores de KM para 2-OG y Mg2+ (100 veces) se redujeron para la conversión de 2-OG a 2-HG (Tabla complementaria 1b), mientras que la kcat se redujo 10 veces en comparación con a IDH1 en peso. Los resultados cinéticos para las conversiones de isocitrato y 2-OG medidos a través del recambio de NADP+ o NADPH son ampliamente consistentes con los ensayos de recambio de 1H NMR (Fig. 3a-f complementaria). Los resultados que muestran que la sustitución de S280F disminuye los valores de KM para ambos sustratos y Mg2+ (aparte de la conversión de isocitrato en 2-OG catalizada por IDH1 S280F) son notables porque un trabajo reciente ha demostrado que la unión a la interfaz de dímero alostérico de inhibidores de variantes de IDH1 dificulta la unión de Mg2+ y sustrato18.

Para investigar más a fondo las consecuencias mecánicas de la sustitución de S280F, estudiamos las variantes de IDH1 utilizando voltamperometría cíclica (Fig. 3g-l complementaria), que puede medir las tasas en cada dirección de ciclo de NADP (H) y que puede distinguir la conversión de isocitrato a 2 -OG de la reducción de 2-OG a 2-HG17. Los resultados implican que R132C y R132C/S280F catalizan la conversión de isocitrato en 2-OG con una eficiencia similar (Figura complementaria 3 g/h). Sin embargo, la eficiencia de la conversión general de isocitrato a 2-HG se mejora para R132C/S280F en comparación con R132C (Fig. 1d), y la tasa de conversión de 2-OG a 2-HG se duplica aproximadamente en comparación con IDH1 R132C (Suplementario). Figura 3g/h). Los resultados de la voltamperometría cíclica muestran que, en comparación con el R132H, el R132H/S280F muestra una mayor eficiencia (aproximadamente el doble), tanto para la conversión de isocitrato en 2-OG como de 2-OG en 2-HG (Fig. 3i/j complementaria). IDH1 S280F (sin R132C o R132H) muestra una velocidad de reacción dos veces mayor en comparación con IDH1 wt para la conversión de isocitrato en 2-OG (Fig. 3k / l complementaria).

En general, aunque los tres ensayos de recambio que miden la absorbancia de NADPH, las resonancias de RMN de 1H o los parámetros de voltamperometría cíclica emplearon diferentes condiciones, todos muestran que la sustitución de S280F mejora la eficiencia de las variantes R132C y R132H en la conversión de isocitrato en 2-HG, principalmente al aumentar la tasa de reducción de 2-OG a 2-HG.

Estudios previos han demostrado que la mayoría de los inhibidores de variantes de IDH, probablemente incluido ivosidenib (no hay una estructura cristalina informada para ivosidenib complejado con una variante de IDH1), se unen en la interfaz de dímero IDH1/IDH221,22,23,24,25,26. Recientemente hemos demostrado que la interrupción de la unión de Mg2+ mediada por inhibidores ocurre de una manera que afecta de manera desproporcionada la conversión de 2-OG a 2-HG, en comparación con la reacción de tipo salvaje de isocitrato a 2-OG18. En consonancia con los resultados anteriores con NOG e isocitrato, los análisis DSF implican que se requiere Mg2+ para la unión eficiente de isocitrato y 2-OG a R132C, R132C/S280F, R132H y R132H/S280F (Fig. 3m/n complementaria). Es posible que la sustitución S280F aumente la afinidad de la unión de Mg2+, al menos para la conversión catalizada por R132C/R132H de 2-OG a 2-HG.

Luego investigamos la inhibición de R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F aislados por ivosidenib (Fig. 2a; Fig. 4a complementaria). Los análisis de NMR y MS demuestran que la sustitución S280F reduce la eficiencia de unión de ivosidenib (Fig. 2b) y que la estequiometría de la unión de ivosidenib es una molécula inhibidora por dímero (Fig. 2c); estas observaciones son consistentes con trabajos previos sobre la inhibición de IDH1 wt y R132H por ivosidenib18. Se ha propuesto, en base a estudios de modelos15,16, que la resistencia a ivosidenib está mediada por el impedimento de la unión del inhibidor debido a la sustitución de S280 con una fenilalanina más exigente estéricamente (S280F), y que la unión de ivosidenib se ve obstaculizada adicionalmente por la pérdida de un enlace de hidrógeno a la cadena lateral del alcohol de S28016. Para investigar si la resistencia está mediada únicamente por el impedimento estérico o si intervienen otros factores, incluidos los relacionados con una posible pérdida de un enlace de hidrógeno con el S280, producimos R132C/S280A. Ivosidenib no inhibe (al menos, de manera eficiente) R132C/S280F o R132H/S280F (Fig. 2a), pero inhibe R132C/S280A con una CI50 de 992 nM, en comparación con una CI50 de 2,5 nM para R132C (Fig. 4b complementaria). Esta observación sugiere que el impedimento estérico de la cadena lateral de fenilalanina y la pérdida de un enlace de hidrógeno con S280 pueden contribuir a la resistencia a ivosidenib (R132C/S280A se inhibe con menos potencia que R132C mientras que R132C/S280F no inhibe) (Fig. 2a) ; Fig. 4b complementaria). Esta propuesta es consistente con los estudios de unión de inhibidores que emplean MS no desnaturalizante y CPMG NMR (Fig. 2b), que muestran una disminución en la afinidad de R132C/S280A por ivosidenib en comparación con R132C, pero que la disminución es más sustancial para R132C/S280F (Figura 2b).

a Inhibición (%) de variantes de IDH1 (400 nM) por ivosidenib (10 µM) según lo determinado por el ensayo de absorbancia de NADPH. Errores: errores estándar de la media (n = 3 réplicas independientes medidas en la misma placa de 96 pocillos). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b KD determinadas por MS no desnaturalizante (enzima 20 µM, errores técnicos: n = 3 para los estados de carga z = 19, 20, 21) y utilizando la secuencia de RMN de pulso del Proyecto CPMG (enzima 10 µM, n = 2). MS no desnaturalizante: tampón de citrato amónico (200 mM, pH 7,5); RMN de CPMG: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10 %, pH 7,5. c Análisis de MS no desnaturalizante que mide la unión de ivosidenib a variantes de IDH1. A 20 µM, las variantes de IDH1 son predominantemente diméricas con 2 moléculas de NADP(H) unidas: línea discontinua. El fondo verde corresponde a la unión de una molécula de ivosidenib. Concentraciones finales de ivosidenib: 5 µM (4:1), 20 µM (1:1) y 160 µM (1:8). Voltaje de cono: 100 V.

Los resultados combinados muestran que la sustitución S280F debilita la unión de ivosidenib y promueve la conversión de 2-OG en 2-HG. En particular, la sustitución del segundo sitio S280F también promueve, al menos en comparación con las sustituciones individuales R132C o R132H, la conversión de isocitrato en 2-HG en ausencia de inhibidor (Fig. 1d). Curiosamente, IDH1 S280F (sin R132C o R132H) ha aumentado la eficiencia catalítica para la conversión de isocitrato a 2-OG, pero no para la reducción de 2-OG a 2-HG en comparación con IDH1 wt (Tabla complementaria 1a/b; Fig. 3k/l), lo que sugiere una cooperación potencial entre los dos sitios de sustitución con respecto al aumento de la eficacia de la conversión general de isocitrato en 2-HG. Tanto para el isocitrato como para el 2-OG, la unión al sustrato (a juzgar por KM) aumenta en IDH1 S280F (Tabla complementaria 1a / b). Para la reducción de 2-OG a 2-HG, la KM de Mg2+ para IDH1 S280F se reduce 100 veces en comparación con IDH1 wt, mientras que no cambia para la conversión de isocitrato a 2-OG. Estas observaciones combinadas implican que la sustitución S280F promueve la unión al sustrato (isocitrato o 2-OG), pero los efectos sobre la unión de Mg2+ dependen de la reacción catalizada, es decir, isocitrato a 2-OG o 2-OG a 2-HG. Esta conclusión es consistente con trabajos recientes que muestran que la unión de sustratos y Mg2+ a variantes de IDH1 implica cambios conformacionales, incluidos los movimientos de las hélices α (α9 y α10) que participan en la formación de la interfaz de dímero18; tenga en cuenta que hay evidencia de que IDH1 manifiesta reactividad de medio sitio27. En particular, ivosidenib y, al menos, algunos otros inhibidores de variantes de IDH también pueden unirse a IDH1 wt (y probablemente a IDH2 wt), pero no los inhiben de manera eficiente18. Estas observaciones ilustran la complejidad de la dinámica conformacional en la interfaz del dímero IDH1 y cómo están vinculadas a la química del sitio activo. Estos problemas mecánicos sutiles, incluida la modulación potencial de Mg2+ y la unión al sustrato, dificultan predecir con precisión cómo se manifestará la unión del ligando alostérico en el sitio de la interfaz del dímero en términos de inhibición. Por lo tanto, seleccionamos un conjunto de 14 inhibidores de variantes de IDH informados contra R132C / S280F y R132H / S280F con enzimas aisladas (Fig. 4a / c complementaria).

Es importante destacar que, aunque siete de los inhibidores no manifestaron inhibición de R132C/S280F o R132H/S280F (incluido uno, SYC-435, que se informó que se une al sitio activo28), los resultados de la detección (Figura 4c complementaria) revelaron que siete de los los inhibidores conservaron la actividad frente a las variantes dobles, es decir, GSK321, GSK864, IDH224, IDH305, IDH556, FT-2102 y DS-1001B. Algunos de estos inhibidores manifiestan alta potencia (IC50s < 100 nM), es decir, IDH224, FT-2102 (solo contra R132H/S280F) y DS-1001B (Fig. 3a). Se seleccionaron inhibidores representativos potentes de cada serie de inhibidores para estudios adicionales (es decir, GSK864, IDH224, FT-2102, DS-1001B). Sorprendentemente, los estudios de MS no desnaturalizantes mostraron que todos estos inhibidores pueden unirse con una estequiometría de 2 moléculas a cada dímero IDH1 (Fig. 3b; Fig. 4d complementaria). Tenga en cuenta que esta observación contrasta con la de ivosidenib, donde solo se observó que una molécula inhibidora se unía al dímero IDH1 (Fig. 2c). La afinidad de unión del inhibidor (determinada por MS no desnaturalizante) fue generalmente más baja para R132C/S280F y R132H/S280F que para R132C y R132H, respectivamente, aunque no se alteró para FT-2102 (Fig. 3c). El inhibidor más potente de R132C/S280F, DS-1001B, también se analizó en un ensayo de solución (empleando CPMG NMR) y se encontró que manifestaba una fuerte unión a todas las variantes probadas, con la afinidad más baja por R132H/S280F (KD = 4,19 µM ) en comparación con las otras variantes de IDH1 probadas (Fig. 3c).

a Valores de IC50 (error estándar de la media, n = 3) con variantes de IDH1 (a 30 nM); ni = no se observa inhibición. Condiciones: Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, DTT 0,2 mM, Tween 20 0,005 % v/v y BSA 0,1 mg/ml (pH 8,0). b Análisis de MS no desnaturalizantes. Línea discontinua: dímero IDH1 (z = 20, con 2 moléculas de NADP(H) unidas), el sombreado verde corresponde a la unión de una molécula inhibidora, el sombreado menta corresponde a la unión de 2 moléculas inhibidoras. Condiciones: variante IDH1 20 µM, inhibidor 20 µM, voltaje cónico: 100 V. c Determinaciones de KD (errores estándar de la media) medidas por MS no desnaturalizante (enzima 20 µM, errores técnicos: n = 3 para z = 19, 20, 21 estados de carga) y CPMG NMR (valores entre paréntesis, enzima 10 µM, n = 2). MS no desnaturalizante: tampón de citrato amónico (200 mM, pH 7,5); RMN de CPMG: Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM y D2O al 10 %, pH 7,5.

Los ensayos de recambio que emplean el ensayo de absorbancia de NADPH implican que la inhibición de R132C, R132C/S280F, R132H y R132H/S280F es aparentemente competitiva con respecto a los niveles de Mg2+ y 2-OG; la potencia del inhibidor no se vio sustancialmente influenciada por las variaciones en las concentraciones de NADPH, excepto potencialmente con FT-2102 (Fig. 5a-c complementaria).

Para investigar más a fondo los efectos de la sustitución de S280F en la unión del inhibidor, trabajamos para adquirir información cristalográfica y obtuvimos una estructura de R132C/S280F complejada con calcio, 2-OG y NADPH (resolución de 2,1 Å, grupo espacial: C2221, tres moléculas (A –C) en la unidad asimétrica (Fig. 6a complementaria), PDB: 7PJM, la estructura se resolvió usando una estructura reportada de R132H, como modelo de búsqueda19; Fig. 4a–d).

una vista de cinta de una estructura cristalina de R132C/S280F (PDB: 7PJM, resolución de 2,1 Å). Como se observa en la unidad asimétrica, un aparente dímero está formado por la cadena A (trigo) y la cadena B (verde). Círculos naranjas: sitios activos con 2-OG, NADPH y calcio. Bucle L1: violeta. b Vista de primer plano con un mapa de omisión de Polder (malla azul, contorno 3,0 σ) que muestra 2-OG, NADPH y calcio. El bucle L1 que cubre la interfaz del dímero está en violeta. Círculo negro: interfaz de dímero con un mapa de omisión de pólder (malla azul, contorno: 3,0 σ) que muestra F280 (cian). c Vista de la interfaz de dímero que destaca las interacciones hidrofóbicas entre W124 (L1), F280 (cian, α10) y W267 en ambos monómeros. d Vista del sitio de unión de metal. Se muestran los residuos de unión al calcio D252 (monómero 1, trigo, α9), D275 y D279 (monómero 2, verde, α10). e Vista de cinta de una estructura cristalina de R132C/S280F (PDB: 7PJN), resolución de 2,45 Å) complejada con 2 moléculas de NADPH y 2 de DS-1001B (naranja); es probable que la enzima esté en una conformación inactiva abierta. Un aparente dímero está formado por la cadena B (trigo) y la cadena C (verde), como se observa en la unidad asimétrica. DS-1001B se une en la interfaz de dímero (círculo negro). f Mapa de omisión de pólder (malla azul, contorno: 3,0 σ) que muestra DS-1001B y residuo F280 (cian) en la interfaz de dímero. Tenga en cuenta que el bucle L1 (violeta) cubre la interfaz de dímero.

La comparación con las estructuras IDH1 reportadas19,29 implica que la estructura R132C/S280F probablemente refleja una conformación de sitio activo cerrado (los anchos de las dos hendiduras del sitio activo en el homodímero aparente formado por las cadenas A y B medidas por las distancias entre I76 y L250, que son residuos en la entrada del sitio activo 29, son 12.6 Å y 13.0 Å, lo que indica una conformación cerrada 29; Fig. 6b / c complementaria). La estructura revela que los anillos de fenilo de los dos residuos S280F, ubicados en α10, son adyacentes entre sí en la interfaz del dímero (Fig. 4a/b); junto con las cadenas laterales de W124 y W267, el grupo fenilo de S280F crea una región hidrófoba aumentada en la interfaz del dímero (Fig. 4c), lo que posiblemente refleja las estabilidades térmicas aumentadas de las variantes S280F (Fig. 1b; Fig. 1j complementaria) .

En la estructura R132C/S280F, es notable que el bucle L1, que cubre parcialmente el bolsillo de unión del inhibidor30 (Fig. 4b; Fig. 7a/b complementaria), adopta una conformación diferente en comparación con la observada en una estructura cristalina R132H complejada con calcio, 2-OG y NADPH19. Aunque la diferencia en la conformación del bucle L1 podría (en parte) reflejar diferentes condiciones de cristalización, esta observación respalda la importancia de los movimientos conformacionales durante la catálisis y la inhibición de IDH1. Además, existen diferencias en la conformación del residuo de unión a metal Asp-252 (Fig. 4d; Fig. 7c / d complementaria) en la estructura R132C / S280F en comparación con las observadas en otras estructuras, incluido R132H19. Sin embargo, la naturaleza general de la unión de 2-OG, que incluye la quelación por el ion de calcio, no cambia en las diferentes estructuras (Fig. 7d complementaria).

Obtuvimos una estructura cristalina de R132C/S280F complejada con NADPH y su potente inhibidor DS-1001B (resolución de 2,45 Å, grupo espacial: P21212, cuatro moléculas (A – D) en la unidad asimétrica (Fig. 8a complementaria), PDB: 7PJN La estructura se resolvió utilizando una estructura unida a un inhibidor notificada de R132H como modelo de búsqueda31; Fig. 4e/f). De acuerdo con los resultados de la EM no desnaturalizante (Fig. 3b), la estructura revela dos moléculas de DS-1001B unidas en la interfaz de dímero (Fig. 4e). Curiosamente, las dos moléculas de DS-1001B se unen de tal manera que sus anillos de triclorofenilo están adyacentes, una observación de interés con respecto a los futuros esfuerzos de química médica destinados a mejorar la unión del inhibidor (Fig. 4f). La estructura del complejo DS-1001B probablemente refleja una conformación abierta o semiabierta (inactiva): el ancho de las dos hendiduras del sitio activo en el homodímero aparente formado por la cadena B y la cadena C, medido por las distancias entre I76 y L250, es de 17,7 Å. (semiabierto) y 20.2 Å (abierto; Fig. 8b / c complementaria). Como se informó anteriormente para la conformación inactiva23, α10 en ambos monómeros está parcialmente desordenado y asume una conformación de bucle parcial (Fig. 9 complementaria), lo que potencialmente ayuda a acomodar la unión del inhibidor. En particular, en contraste con la estructura de R132C/S280F sin inhibidor, en la estructura complejada de DS-1001B, los residuos de S280F de los dos monómeros no son adyacentes sino separados por 14,9 Å (átomo C más cercano, Fig. 10 complementaria).

Aunque se debe tener cuidado de no sobreinterpretar las diferencias en las estructuras cristalinas obtenidas en diferentes condiciones, de acuerdo con los estudios de solución, nuestros resultados cristalográficos muestran que la sustitución S280F afecta la química en la interfaz de dímero donde probablemente se une ivosidenib y que tiene potencial para afectar la química del sitio activo, incluso con respecto a la unión de iones metálicos y, como consecuencia, la unión del sustrato. Cuando se combinan con otras estructuras y estudios cinéticos y biofísicos recientes18,27, estos resultados biofísicos resaltan aún más el papel de la dinámica conformacional y la complejidad en la catálisis IDH (variante). Definir la naturaleza precisa de estos y sus efectos de inhibición es un desafío y requiere estudios estructurales sobre los volúmenes de negocios individuales junto con el modelado. Por lo tanto, proponemos que la inhibición de la variante IDH, incluso con respecto a la lucha contra las resistencias, debe perseguirse principalmente mediante un enfoque guiado empíricamente que emplee diferentes tipos de ensayos de rotación y unión vinculados a estudios celulares en una etapa temprana.

El apoyo a este enfoque proviene de los resultados de estudios celulares sobre cinco inhibidores R132C/S280F seleccionados (potenciales), es decir, ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102 y DS-1001B (Fig. 5). Se usó una línea celular de glioblastoma LN-18 (ATTC CRL-2610) para producir variantes de IDH1 recombinantes (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) como se informa en la Fig. 11 complementaria.

Las células LN18 se trataron con los inhibidores ivosidenib, GSK864, FT-2102, IDH224 y DS-1001B en DMSO (concentración final: 5 µM). Los niveles de 2-HG se determinaron mediante cromatografía de intercambio de aniones acoplada a MS51 (errores: errores estándar de la media, n = 4 réplicas independientes). Tenga en cuenta que, mientras que ivosidenib no es o es poco activo para reducir los niveles de 2-HG en células portadoras de R132C/S280F y R132H/S280F, los otros inhibidores son activos para reducir los niveles de 2-HG. Las células de control se generaron por transducción con vectores lentivirales que no contenían IDH1. Gráficos de caja y patillas: la línea central es la mediana y los límites son los valores de los percentiles 25 y 75. Los bigotes son los niveles mínimo y máximo medidos de 2-HG para cada grupo experimental. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se anticipó, con las células de control, que no expresan ninguna variante de IDH1, los inhibidores no tuvieron ningún efecto detectable, con error, en los bajos niveles de 2-HG endógeno presente (Fig. 5). De acuerdo con los resultados informados24,26,32, todos los inhibidores suprimieron de manera eficiente la producción de 2-HG en células que producían en exceso R132C y R132H. Por el contrario, los efectos de los cinco inhibidores sobre las células que producían en exceso R132C/S280F o R132H/S280F variaron. De acuerdo con los datos bioquímicos que muestran que la sustitución S280F causa resistencia a ivosidenib y los resultados clínicos previos14,15,16, ivosidenib fue ineficaz para suprimir la producción de 2-HG en las células superproductoras de R132C/S280F y R132H/S280F (Fig. 5). En las células superproductoras de R132C/S280F, GSK864 fue solo moderadamente potente para reducir los niveles de 2-HG, mientras que IDH224, DS-1001B y FT-2102 fueron más potentes para reducir los niveles de 2-HG. Curiosamente, FT-2102 fue relativamente menos potente que IDH224 y DS-1001B contra R132C/S280F aislado (Fig. 3a; IC50 1,3 µM). La potencia relativamente alta de FT-2102 en las células puede reflejar una mayor permeabilidad celular en comparación con IDH224 y DS-1001B.

En el caso de R132H/S280F (Fig. 5), los resultados del tratamiento con ivosidenib, GSK864, IDH224 y FT-2102 fueron análogos a los de las células portadoras de R132C/S280F. Sorprendentemente, sin embargo, DS-1001B fue un inhibidor relativamente pobre de R132H/S280F en este contexto celular. Esta diferencia probablemente refleja, al menos en parte, la mayor IC50 para DS-1001B frente a R132H/S280F aislado en comparación con los valores de las otras variantes de IDH1 probadas (Fig. 3a).

Aunque existen diferencias en las eficiencias relativas de los inhibidores, como se describió anteriormente, los resultados celulares se correlacionan bien con los resultados de las variantes IDH1 aisladas. Lo que es más importante, revelan que inhibidores específicos, incluidos FT-2102 y DS-1001B, que se encuentran en ensayos clínicos de fase 233,34,35, son eficaces para reducir los niveles de 2-HG en células portadoras de R132C/S280F.

El desarrollo de inhibidores de variantes de IDH es un gran avance en el tratamiento del cáncer, ya que es un ejemplo pionero de cómo los fármacos de molécula pequeña pueden atacar con éxito el metabolismo. Sin embargo, como se anticipó, ha surgido resistencia al fármaco pionero ivosidenib, en particular, a través de la sustitución S280F en la interfaz del dímero14,15,16. Los resultados de la detección de inhibidores con variantes IDH1 aisladas revelan que ni las variantes R132C/S280F ni R132H/S280F son inhibidas (eficientemente) por ivosidenib. Sin embargo, es importante destacar que este resultado también es el caso de algunos, pero no todos, de los inhibidores variantes de IDH informados actualmente en desarrollo. Por lo tanto, debería ser posible superar la resistencia a los inhibidores de variantes de IDH causada por mutantes de interfaz de dímero mediante programas de química médica apropiados.

Los resultados bioquímicos y estructurales combinados muestran que la sustitución S280F permite la resistencia a ivosidenib en células cancerosas que producen R132C/S280F o R132H/S280F, en parte al dificultar su unión a la interfaz del dímero IDH1 y en parte al aumentar la eficiencia de las variantes R132C y R132H. al catalizar la conversión de isocitrato y/o 2-OG a 2-HG. Los estudios informados aquí y en otros lugares18 implican que la unión alostérica de los inhibidores de la variante IDH en la interfaz del dímero afecta la unión del sitio activo Mg2+ (o complejo Mg2+-sustrato en el caso del isocitrato) de una manera que inhibe desproporcionadamente la conversión de 2-OG a 2-HG en comparación con la conversión de isocitrato a 2-OG. Las razones moleculares precisas de estas observaciones, junto con los detalles de la catálisis wt de IDH1, deberían ser objeto de futuros estudios biofísicos de resolución temporal.

Aunque se desconoce la relevancia del cáncer in vivo del aumento de la eficiencia catalítica observado de R132C S280F in vitro, puede ayudar a mantener niveles elevados de 2-HG en presencia de un inhibidor de la variante IDH. Si es así, respalda un papel funcional para 2-HG en células cancerosas maduras y, en consecuencia, un tratamiento basado en inhibidores que da como resultado una reducción en los niveles de 2-HG; tenga en cuenta que la función de 2-HG en las células cancerosas maduras puede ser diferente o adicional a la función propuesta de los niveles elevados de 2-HG en la tumorigénesis36,37.

A pesar de la complejidad mecánica de la inhibición de la variante IDH1 por la unión alostérica, nuestros resultados muestran claramente que la resistencia al ivosidenib mediada por R132C/S280F se puede superar mediante el uso de otros inhibidores, por ejemplo, IDH224, FT-2102, DS-1001B, y probablemente variantes mejoradas de estos . Al igual que el ivosidenib, estos inhibidores también se unen en la interfaz del dímero; sin embargo, a diferencia de ivosidenib, que se une con una estequiometría de una molécula inhibidora por dímero variante de IDH1, los inhibidores potentes de R132C/S280F (como lo demuestran los estudios bioquímicos y celulares) se unen con una estequiometría de dos moléculas inhibidoras por dímero, como lo demuestra la no desnaturalización. Estudios de MS y análisis cristalográficos de R132C/S280F con y sin inhibidor. Es importante destacar que dos inhibidores de R132C/S280F y R132H/S280F, FT-2102 y DS-1001B ya se encuentran en ensayos clínicos de fase 233,34,35. Por lo tanto, existe la posibilidad de desarrollar regímenes de tratamiento eficientes que impliquen la sustitución de una variante inhibidora de la IDH por otra a medida que surge la resistencia. También existe la posibilidad de usar combinaciones de inhibidores, en particular cuando los tipos de resistencia que probablemente surgirán pueden predecirse antes del tratamiento inicial.

Estudios recientes sobre los mecanismos de IDH1 y sus variantes y el modo de acción de los inhibidores de variantes de IDH informados18 han llevado a sugerir que los inhibidores alostéricos se identificaron preferentemente en parte como consecuencia de las condiciones de selección utilizadas, es decir, las pruebas de detección no se llevaron a cabo con variadas concentraciones de Mg2+. La naturaleza de S280F permitió la resistencia de ivosidenib a R132C/S280F sugiere que el desarrollo de nuevos tipos de inhibidores de IDH, incluidos los que no funcionan por unión alostérica a la interfaz de dímero, es de interés. Es posible que la unión de inhibidores en la interfaz del dímero IDH, que está involucrada en cambios conformacionales sutiles durante la catálisis, sea particularmente propensa a la resistencia en comparación con aquellos que se unen en el sitio activo y/o compiten con NADPH. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la sustitución S280F confiere resistencia a un inhibidor, SYC-435, que, según se informa, se une al sitio activo de IDH128.

Debido a los limitados datos clínicos disponibles en esta etapa, es difícil predecir cómo surgirá la resistencia a los inhibidores de variantes de IDH. Por lo tanto, sugerimos que, junto con la optimización de los inhibidores actualmente efectivos, que se unen en la interfaz del dímero, vale la pena desarrollar inhibidores de la variante IDH que funcionen a través de mecanismos que no impliquen la unión alostérica. Nuestros resultados también implican que los futuros esfuerzos de química médica deberían emplear de manera óptima múltiples variantes de IDH1/2, incluidas mutaciones que permiten la resistencia en forma aislada (en diferentes condiciones de ensayo), así como análisis celulares e in vivo guiados empíricamente.

Se diseñaron cebadores directos e inversos para introducir diferentes mutaciones de acuerdo con los procedimientos informados38. Se usó un plásmido pET22b (Sigma-Aldrich) como plantilla. IDH1 R132H/S280F y R132C se prepararon a partir de una plantilla de ADN de IDH1 R132H (obtenida como se describe18). IDH1 R132C/S280F y R132C/S280A se hicieron a partir de una plantilla de ADN R132C. IDH1 S280F se hizo a partir de una plantilla de ADN de IDH1 wt. Las reacciones se llevaron a cabo (método de 2 pasos) utilizando la polimerasa de ADN de alta fidelidad Q5® (New England Biolabs), una mezcla de solución de desoxinucleótidos (New England Biolabs) y un GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). La mezcla se purificó usando el kit de purificación GeneJET PCR (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN molde se digirió usando Dpn1 (New England Biolabs; 3 h de incubación, 37 °C). El producto se transformó en células XL10-gold (Agilent). Las colonias se cultivaron durante la noche en 10 ml de medio 2TY y el plásmido se extrajo con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Los plásmidos se eluyeron con agua purificada MilliQ. Las secuencias se confirmaron mediante secuenciación de Sanger realizada por Eurofins Scientific.

La producción de proteína recombinante se realizó como se describe17,18. En resumen, las proteínas recombinantes se produjeron en células BL21(DE3)plysS E. coli con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM con una temperatura posterior a la inducción de 20 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se lisaron por sonicación. Los lisados celulares se cargaron en una columna HisTrap HP de 5 ml (Cytiva) y se eluyeron con un gradiente escalonado de imidazol (hasta 500 mM). Las fracciones que contenían la proteína deseada se purificaron adicionalmente utilizando una columna Superdex S200 (GE Healthcare, 300 ml) mediante elución isocrática. La pureza de las fracciones se evaluó mediante electroforesis en gel SDS PAGE (Fig. 1a complementaria). Las concentraciones de proteína se determinaron usando una máquina Nanodrop One (Thermo Scientific) y corresponden a la concentración de monómero IDH1.

Para los estudios cristalográficos, IDH1 R132C/S280F se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico. Después de la purificación inicial con una columna HisTrap HP de 5 ml (Cytiva), las fracciones que contenían la proteína deseada se sometieron a intercambio de tampón con una columna PD-10 (Merck) y se cargaron en una columna Cytiva Q Sepharose Fast Flow. La proteína se eluyó con un gradiente de NaCl (hasta 1 M) y luego se sometió a purificación por filtración en gel (columna Superdex S200 (GE Healthcare, 300 mL), con elución isocrática utilizando tampón que contenía Tris 20 mM y NaCl 100 mM (pH 7,4).

Para experimentos electroquímicos, Ferredoxin-NADP+ reductasa (FNR) de Chlamydomonas reinhardtii se produjo como se describe39. En resumen, se produjo FNR recombinante en células de E. coli BL21(DE3)plysS mediante la adición de IPTG 1 mM, y los cultivos se cultivaron durante 4 h más (37 °C). Las células se recogieron por centrifugación; los sedimentos se resuspendieron en un pequeño volumen de tampón frío (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM; pH 7,4) y se almacenaron durante la noche a -80 °C. Las células se descongelaron y lisaron usando una prensa francesa a 20 psi, y el lisado se centrifugó a 4 °C usando una ultracentrífuga (Beckman L8-70M Ultracentrífuga). FNR se aisló del sobrenadante usando una columna de afinidad Ni2+ HisTrap HP (GE Healthcare Life Sciences) y se eluyó de la columna usando un gradiente de imidazol (concentración final de imidazol 250 mM). Las fracciones que contenían FNR se seleccionaron en función de la absorbancia a 280 nm y 460 nm. Las fracciones que contenían FNR se combinaron y concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra-4 mL (10 kDa) hasta un volumen final de alrededor de 2 mL. Luego, la solución concentrada de FNR se aplicó a una columna de desalinización (PD-10; GE Healthcare) para eliminar el imidazol. La enzima se separó en alícuotas de un solo uso, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenó a -80 °C.

La cinética enzimática se determinó espectrofotométricamente en función de los cambios en la concentración de NADPH medidos por su absorción a 340 nm (ε = 6220 M–1 cm–1). Los análisis se realizaron en placas de microtitulación transparentes de media área de 96 pocillos (Greiner Bio-One 675001) utilizando un lector de microplacas PHERAstar FS a 25 °C en un volumen de reacción de 100 µL. Este ensayo se utilizó para estudiar la cinética en estado estacionario y la inhibición de reacciones catalizadas por variantes de IDH1. El tampón de ensayo fue Tris 100 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol (DTT) 0,2 mM, Tween 20 al 0,005 % (v/v) y albúmina sérica bovina (BSA) 0,1 mg mL−1 (pH 8,0). Para los ensayos de inhibición, las variantes de IDH1 se incubaron con un inhibidor durante 12 minutos antes de que se iniciara la reacción mediante la adición de sustrato. El error estándar se derivó del ajuste de la curva utilizando GraphPad Prism v9. Consulte las leyendas de las figuras para obtener detalles sobre ensayos cinéticos específicos (Figs. 1–3; Fig. 5 complementaria; Tabla 1 complementaria).

La sal disódica de 2-oxoglutarato (2-OG), la sal tetrasódica de NADPH (~98 %), la sal disódica de NADP+, la sal de potasio de D-isocitrato y MgCl2 × 6 H2O eran de Sigma-Aldrich. La sal trisódica del ácido DL-isocítrico era de ChemCruz. Los inhibidores procedían de MedChemExpress, BioVision, DC Chemicals, Sigma-Aldrich, Enzo Life Sciences, Cambridge Bioscience Ltd. GSK321 y GSK864 fueron proporcionados amablemente por GSK. Las soluciones madre se prepararon en DMSO (10 mM).

Las variantes de IDH1 se cambiaron de tampón por tampón de RMN (Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, D2O al 10 %, pH 7,5) usando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) según el protocolo del fabricante. Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se obtuvieron utilizando un espectrómetro de RMN Bruker AVIII de 700 MHz equipado con una criosonda TCI 1H/13C/15N inversa de 5 mm. Se añadieron MgCl2 (10 mM), isocitrato/2-OG y NADP+/NADPH para los ensayos de recambio, y el recambio se controló mediante RMN 1H (NS: 16, retardo de relajación: 2 s). La señal de agua fue suprimida por escultura de excitación. Los datos se analizaron utilizando Mestrenova.

Las variantes de IDH1 se cambiaron de tampón por tampón de RMN (Tris-d11 50 mM, NaCl 100 mM, D2O al 10 %, pH 7,5) y se concentraron usando filtros ultracentrífugos Amicon (0,5 ml, corte: 50 kDa) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los experimentos se realizaron con inhibidor 10 µM (de una solución madre de d6-DMSO 10 mM). En esta solución se tituló la variante IDH1 y se aplicó la secuencia PROJECT-CPMG40. Los parámetros experimentales fueron los siguientes: tiempo de eco total, 40 ms; retardo de relajación, 2 s. La supresión de agua se logró mediante presaturación. El porcentaje de complejo proteína-inhibidor ([PL]/([P] + [PL]) se representó gráficamente frente a la concentración de inhibidor. Los datos se analizaron con Mestrenova y la constante de disociación se calculó mediante regresión no lineal con GraphPad Prism (versión 9 ).

Las variantes de IDH1 se cambiaron de tampón por tampón de fosfato de sodio (10 mM, pH 8,0) usando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las mediciones de CD utilizaron un espectrómetro de CD Chirascan (Fotofísica aplicada) equipado con un soporte de celda con control de temperatura Peltier. Los espectros se registraron en un rango de 260 a 185 nm (intervalos de 0,5 nm). Las mediciones se realizaron por triplicado a 23 °C y el fondo se restó del de la muestra. Los espectros se promediaron y suavizaron utilizando el filtro Savitzky-Golay (tamaño de ventana 4). Los datos se normalizaron a la concentración de proteína (medida usando una máquina NanoDrop One) y la elipticidad media del residuo se calculó de acuerdo con la fórmula [Eq. 1]:

Para analizar la estabilidad térmica de las variantes de IDH1, la longitud de onda se fijó en 215 nm y la temperatura aumentó gradualmente de 10 a 80 °C. La velocidad de calentamiento fue de 1 °C min−1 y la señal de CD se midió cada 2 °C (±0,4 °C). Los espectros se suavizaron utilizando el filtro Savitzky-Golay (polinomio de cuarto orden, 12 vecinos) de GraphPad Prism (versión 9). La temperatura de fusión se calculó utilizando un modelo sigmoidal de Boltzmann con Graph Pad Prism (versión 9); el error estándar se derivó del ajuste de la curva utilizando el modelo sigmoidal de Boltzmann.

Las mediciones se realizaron en tampón Tris (50 mM, pH 7,4) con proteína 3 µM y Sypro Orange 3x en un termociclador Bio-Rad CFX96. La tasa de calor fue de +0,2 °C s−1 en un rango de 20 a 95 °C. Los datos se analizaron utilizando Bio-Rad CFX Manager 3.1. El error estándar se derivó de tres réplicas independientes.

Se utilizaron geles Novex™ WedgeWell™ 4–12% Tris-glicina. La cámara de gel (Invitrogen) se enfrió en un baño de hielo y la electroforesis en gel se llevó a cabo en una habitación fría (4 °C) utilizando el tampón de ejecución NativePAGE (Invitrogen). La electroforesis en gel se llevó a cabo durante 1,5 h a 160 V y el gel se tiñó con InstantBlue Coomassie (Expedeon).

Las mediciones de SEC-MALS se realizaron utilizando un detector de dispersión de luz de 8 ángulos Wyatt Dawn HELEOS-II y un monitor de índice de refracción Wyatt Optilab rEX conectado a un sistema HPLC Shimadzu que comprende una bomba LC-20AD, un muestreador automático SIL-20A y un detector UV/Vis SPD20A. Las muestras se analizaron con una columna Superdex 200 HR10/30 con un caudal de 0,5 ml min−1. La concentración de la muestra fue de 1 mg mL−1 en un tampón que contenía Tris (20 mM, pH 7,4) y NaCl (100 mM).

Los experimentos electroquímicos se realizaron en una caja de guantes anaeróbica (Glove Box Technology) que contenía una atmósfera de nitrógeno (O2 < 1 ppm). El aparato electroquímico (una celda electroquímica de vidrio y electrodos giratorios de borde de grafito pirolítico (PGE)) fue como se informó anteriormente17. Se utilizó un potenciostato Autolab PGSTAT 10 que usaba el software Nova para realizar experimentos electroquímicos. Los potenciales de electrodo (E) se midieron frente a un electrodo de calomelano saturado (SCE) y se convirtieron al electrodo de hidrógeno estándar (SHE) mediante una ecuación de conversión de potencial dependiente de la temperatura (a 25 °C, la conversión es: ESHE = ESCE + 0,241 V)17 . El contraelectrodo era un alambre de platino. Se fabricaron electrodos nanoporosos de óxido de indio y estaño (ITO) depositando electroforéticamente nanopartículas de ITO (<50 nm, Sigma-Aldrich) en electrodos de borde de grafito pirolítico (ITO/PGE)17. Las enzimas se cargaron en el electrodo arrojando una solución de enzimas mixtas de 4 a 6 µl en el electrodo de ITO y permitiéndole incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos mientras se aseguraba de que la solución no se evaporara. En todos los casos, se usaron 0,85 nmol (base de homodímero) de IDH1 (tipo salvaje y todas las variantes); la cantidad de FNR que se cargó conjuntamente se ajustó para lograr la relación de enzima final deseada. Todas las variantes neomórficas de IDH1 (R132C, R132C/S280F, R132H, R132H/S280F) se cargaron en una relación molar de 2,5 a 1 con FNR (es decir, se cargó 2,5 veces más (equivalente molar de homodímero) de cada variante de IDH1 en relación con FNR para cada experimento). Por el contrario, IDH1 wt e IDH1 S280F se cargaron en una proporción molar de 1 a 8 con FNR para garantizar que el sistema no estuviera limitado por FNR debido a que estas enzimas IDH1 oxidan el isocitrato de DL a una velocidad mucho más rápida que las variantes neomórficas de IDH1. Las concentraciones de IDH1 se calcularon en función de sus homodímeros. Los electrodos cargados con enzima se enjuagaron minuciosamente con una solución tampón antes de sumergirlos en el tampón de reacción para cada experimento para garantizar que no hubiera enzima libre en la solución.

Las variantes de IDH1 se cambiaron de tampón por tampón MS no desnaturalizante (acetato de amonio, 200 mM, pH 7,5) usando columnas Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los experimentos de MS sin desnaturalización se llevaron a cabo utilizando un instrumento cuadrupolo-TOF (Waters Synapt G2Si) y un automuestreador ESI basado en chip Advion Triversa Nanomate. Los inhibidores se disolvieron en MeOH y se agregaron a la solución de proteína (concentración de proteína final: 20 µM). Se aplicó un voltaje de pulverización de 1,7 a 1,8 kV (presión de gas de respaldo de pulverización de 0,6 psi, presión de entrada de 3,7 mbar). Los voltajes del cono de muestra fueron de 100 V y 5,2 V. Los espectros se analizaron con Mass Lynx (versión 4.1), incluido el centrado y el suavizado. El porcentaje de complejo proteína-inhibidor ([PL]/([P] + [PL]) se representó gráficamente frente a la concentración de inhibidor. Se aplicó una corrección de referencia y la constante de disociación se calculó mediante regresión no lineal con GraphPad Prism (versión 9 ).

Se usó IDH1 R132C/S280F (25,62 mg ml-1 en Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) para la cristalización mediante el método de difusión de vapor de gota sentada. Para la configuración de la gota sentada, se utilizó una placa Cryschem de 24 pocillos (Hampton Research, EE. UU.) con una solución de depósito de 250 µL19. Una pantalla que varía la concentración de PEG (PEG3350 15–20 %, eje horizontal en pasos de 1 %) y la concentración de sal (acetato de calcio 200 o 225 mM, eje vertical; con o sin semillas, respectivamente) y Bis-Tris (0,1 M) a pH 7 se llevó a cabo. La enzima (25 µL) se incubó durante 1 h en hielo con NADPH 10 mM (en H2O, 10 µL), CaCl2 20 mM (en H2O, 5 µL) y 2-OG 200 mM (en H2O, 10 µL) para producir una concentración final de proteína de 12,81 mg mL−1. La cristalización se consiguió mediante la adición de 2 µl de la solución que contenía proteína a 2 µl de solución precipitante. Las placas se sellaron con StarSeal Advanced Polyolefin Film (Starlab, Alemania); los cristales (tamaño medio 100 µM) se manifestaron en 14 días. Para obtener cristales de manera reproducible, se empleó siembra con trituración de cristales utilizando el kit SeadBeat (Hampton Research, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las gotas que contenían cristales se crioprotegieron mezclándolas en una proporción de 1:1 con una solución de depósito que contenía glicerol (25 % (v/v)), se recogieron con un bucle de nailon y se crioenfriaron en N2 líquido. Los cristales se almacenaron en N2 líquido hasta que se requirieron para la recolección de datos.

Los datos se recopilaron a 100 K utilizando la línea de luz I24 de Diamond Light Source (DLS). Los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando la estrategia Xia241 de la canalización de procesamiento automático de la línea de luz (Tabla complementaria 4). La estructura cristalina de IDH1 R132C/S280F se determinó mediante reemplazo molecular (MR) usando la subrutina AutoMR (PHASER42) en PHENIX43. El modelo de búsqueda utilizado para RM se basó en IDH1 R132H (PDB: 4KZO19). El modelo estructural se optimizó mediante ciclos iterativos de reconstrucción manual en COOT44 y refinamiento cristalográfico en Phenix.refine45 (los detalles del refinamiento se resumen en la Tabla complementaria 4).

Para la cristalización se usó IDH1 R132C/S280F (25,62 mg·ml-1 en Tris 20 mM, NaCl 100 mM, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 mM, pH 7,4). Para la configuración de la gota sentada, se utilizó una placa Cryschem de 24 pocillos (Hampton Research, EE. UU.) con una solución de depósito de 250 µL, como se informó25. Se realizó una pantalla que variaba la concentración de citrato de amonio (pH 7,0, 0,75–2 M, eje horizontal en pasos de 0,25 M) y la concentración de DTT (1,5–3 mM, eje vertical en pasos de 0,5 mM). La proteína (12,5 µL) se incubó en hielo durante 1 hora con NADPH (10 mM; en tampón que contenía Tris 20 mM, NaCl 100 mM, TCEP 1 mM, pH 7,4; 5 µL), tampón (6,8 µL) y una solución de 10 -Doble el exceso de DS-1001B (en DMSO, 0,7 µL) hasta una concentración de proteína final de 12,81 mg mL−1. A continuación, se añadieron 2 µL de esta solución a 2 µL de solución precipitante. La placa de gotas asentadas se selló con película de poliolefina avanzada StarSeal (Starlab, Alemania), y los cristales aparecieron después de un día. La recolección de cristales se realizó con glicerol como crioprotector como se describe anteriormente.

Los datos se recopilaron a 100 K usando radiación de sincrotrón en la línea de luz DLS I03. Los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando la estrategia Xia241 de la canalización de procesamiento automático de la línea de luz (Tabla complementaria 4). Se obtuvo una solución de MR inicial usando una estructura unida a inhibidor de IDH1 R132H (PDB: 5TQH31). Se reconstruyó un modelo inicial a partir de esta solución MR utilizando PHENIX AutoBuild45,46,47,48,49. El modelo estructural se optimizó mediante ciclos iterativos de reconstrucción manual en COOT44 y refinamiento con Phenix.refine45 (los detalles se resumen en la Tabla complementaria 4). Debido a la resolución limitada (2,45 Å), se utilizaron restricciones NCS en todo momento y refinamiento TLS de factores B (16 grupos TLS para las cuatro cadenas).

Se obtuvieron células de glioblastoma humano LN18 de la ATCC y se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Las células LN18 se modificaron genéticamente para sobreexpresar los transgenes que codifican IDH1 R132H, IDH1 R132C, IDH1 R132H/S280F o IDH1 R132C/S280F mediante la transducción de vectores lentivirales. Primero, la secuencia mutante IDH1 S280F de IDH1 se generó mediante un enfoque basado en PCR recombinante, utilizando los vectores de transferencia lentiviral pCC.sin.36.IDH1R132H.PPTWpre.CMV.tTA-S2tet y pCC.sin.36.IDH1R132C.PPTWpre .CMV.tTA-S2tet50, que contiene las secuencias R132H y R132C de IDH1, como moldes. En esta reacción, se usaron Primer1_forward y Primer1_reverse (Tabla complementaria 2). El amplicón mutante IDH1 S280F se subclonó posteriormente en los mismos vectores de transferencia utilizando BamH1-HF y Nhe1-HF. Posteriormente, las secuencias IDH1 R132H, R132C, IDH1 R132H/S280F o IDH1 R132C/S280F se amplificaron en reacciones de PCR usando Primer2_forward y Primer2_reverse (Tabla complementaria 2) y se clonaron en el vector pUltra-Chili (AddGene), usando Xma1 y NheI- alta frecuencia Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs. Todas las transformaciones bacterianas se realizaron utilizando células ultracompetentes XL10-Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger utilizando Primer3_forward y Primer3_reverse (Tabla complementaria 2).

Todos los plásmidos de transferencia pUltra-Chili mutantes de IDH1 se empaquetaron en vectores lentivirales (LV) mediante transfección transitoria de células HEK293T junto con los 3 plásmidos de empaquetamiento: pVSVg, pREV y pMDL. Las células HEK293T se cultivaron en IMDM (Sigma, I3390) suplementado con FBS al 10 % (Fisher Scientific, 11550356) y antibiótico pen-strep al 5 % (Sigma, P4458). 48 h después de la transfección, se recogió el medio acondicionado HEK293T, se centrifugó y se filtró usando filtros de 0,22 µm. La concentración de antígeno viral p24 se midió utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de perfil central de p24 de VIH-1, ensayo ELISA, kit Lenti-X p24 Rapid Titer de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron diluciones en serie de medio acondicionado recién cosechado para infectar 1,2 × 105 células LN18 en una placa de seis pocillos en presencia de polibreno (8 μg ml−1). Como control, las células se transdujeron con el vector lentiviral pUltra-Chili, que contenía TdTomato, pero no secuencias de IDH1.

El ARN se extrajo utilizando el RNeasy Micro Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando fue necesario, el ADN complementario se transcribió inversamente utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Se usó qPCR para medir la expresión de IDH1 en células de control y transducidas con LV usando una sonda IDH1 TaqMan (Life Technologies) y TaqMan Fast Universal PCR Master-Mix (Applied Biosystems). La reacción se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 5 Dx (Applied Biosystems) con GAPDH como control endógeno (Life Technologies). La expresión de cada gen objetivo se evaluó utilizando un enfoque de cuantificación relativa (método 2 - ΔΔCT).

La solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco filtrada de forma estéril y líquida, el suero bovino fetal (FBS) de origen no estadounidense y el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4500 mg L-1 de glucosa y bicarbonato de sodio, sin L-glutamina, se de Ciencias de la Vida de Merck. El suplemento GlutaMAXTM era de Thermo Fisher Scientific. El dimetilsulfóxido (DMSO) para biología molecular era de Merck. Los filtros de jeringa estériles (15 mm de diámetro, poro de 0,2 µM, membrana RC) eran de Corning. Los inhibidores se disolvieron en DMSO a una concentración de 5 mM y se filtraron antes de su uso con filtros de jeringa Corning® (celulosa regenerada, 18 mm de diámetro, poros de 0,2 µm).

Las células LN18 que contenían un vector vacío o que producían IDH1 R132C, IDH1 R132C/S280F, IDH1 R132H o IDH1 R132H/S280F recombinantes se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 y se cultivaron en DMEM (4500 mg L−1 de glucosa) suplementadas con 10 % (v/v) de FBS y 1% (v/v) de GlutaMAXTM. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos, con 0,7 mL por pocillo a 200.000 células mL−1. Después de 24 h de incubación, el medio original se reemplazó con 0,7 ml de medio fresco (DMEM (4500 mg L−1 de glucosa), FBS al 10 % y GlutaMAX™ al 1 %) con inhibidor 5 µM (ivosidenib, GSK864, IDH224, FT-2102 , DS-1001B) o DMSO al 0,1 % (muestras de control). Las células se incubaron durante 24 h más antes de la recolección. El medio se eliminó por aspiración durante la recolección antes de que los pocillos se lavaran suavemente dos veces con 0,7 ml de PBS por pocillo. Se añadieron 75 µl de metanol acuoso al 80 % (v/v) a cada pocillo y la placa se colocó en hielo seco. Se rasparon las células y se transfirió el contenido de cada pocillo a microtubos separados.

Los extractos celulares se centrifugaron a 14.000 g durante 25 min. La concentración de ADN (ng µL−1) de los sobrenadantes se midió utilizando un ClarioStar Plus con una placa LVis (260 nm). Se agregaron 2.5 µL del sobrenadante a cada pocillo. La placa se blanqueó con 2,5 µl de metanol acuoso al 80 % (v/v) por pocillo antes de medir la concentración de ADN. El sobrenadante de la muestra celular restante se transfirió a viales de Total Recovery (Waters) y se diluyó en relación con la concentración de ADN. El análisis de cromatografía de intercambio aniónico-MS se llevó a cabo como se informó51 usando un sistema de cromatografía iónica de alta presión Dionex ICS-5000+ equipado con una columna de trampa regenerada continuamente, supresor Dionex ERS 500e y AS11-HC (2 × 250 mm, 4 μm) columna, todos de Dionex (Sunnyvale, CA, EUA). Este se acopló directamente a un Q-Exactive HF híbrido cuadrupolo-Orbitrap MS a través de una sonda HESI II, ambas de Thermo Fisher. La temperatura de la columna era de 30 °C y todas las muestras se inyectaron con una inyección de bucle parcial de 5 µL. La fase móvil fueron iones hidróxido acuosos (caudal: 0,250 mL min−1) con el siguiente gradiente: 0 min, 0 mM; 1 minuto, 0 mM; 15 minutos, 60 mM; 25 minutos, 100 mM; 30,1 minutos, 0 mM; 37 minutos, 0 mM. El supresor tenía un caudal de 0,500 mL min−1 y se utilizó en el modo de agua externa. El MS se hizo funcionar en modo de iones negativos con los siguientes parámetros de fuente: tasa de flujo de gas envolvente, 60; caudal de gas auxiliar, 20; tasa de flujo de gas de barrido, 0; tensión de pulverización 3,6 kV; temperatura capilar, 300 °C; nivel de RF de lente S, 70; temperatura del calentador, 350 °C. Los parámetros de escaneo MS y MS/MS fueron: microescaneos, 2; resolución, 7 × 104; objetivo AGC, 1 × 106 iones; TI máxima, 250 ms; recuento de bucles, 10; número de MSX, 1; ventana de aislamiento, 2,0 m/z; energía de colisión, 35; objetivo AGC mínimo, 5 × 103 iones; disparador de ápice 1–15 s; exclusión de carga 3–8, >8; exclusión dinámica, 20,0 s. El tiempo de retención de 2-HG se determinó mediante el análisis de 1 µg mL−1 estándar en metanol acuoso al 80 % (v/v) (grado HPLC, de Sigma-Aldrich).

Los datos cristalográficos generados en este estudio se han depositado en la base de datos PDB con los códigos de acceso 7PJM y 7PJN. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Cualquier información adicional requerida para volver a analizar los datos informados en este documento está disponible a los autores correspondientes previa solicitud. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Hanahan, D. & Weinberg, RA Distintivos del cáncer: la próxima generación. Celda 144, 646–674 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Teicher, BA, Linehan, WM y Helman, LJ Objetivos del metabolismo del cáncer. clin. Cáncer Res. 18, 5537–5545 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J. et al. Metabolismo dirigido en células cancerosas y el microambiente tumoral para la terapia del cáncer. Moléculas 25, E4831 (2020).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Hvinden, IC, Cadoux-Hudson, T., Schofield, CJ & McCullagh, JSO Adaptaciones metabólicas en cánceres que expresan mutaciones de isocitrato deshidrogenasa. Rep. Celular Med. 2, 100469 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Cadoux-Hudson, T., Schofield, CJ & McCullagh, JSO Variantes del gen de la isocitrato deshidrogenasa en el cáncer y su importancia clínica. Bioquímica Soc. Trans. 49, 2561–2572 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dang, L. et al. Las mutaciones IDH1 asociadas con el cáncer producen 2-hidroxiglutarato. Naturaleza 462, 739–744 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yan, H. et al. Mutaciones IDH1 e IDH2 en Gliomas. N. ingl. J.Med. 360, 765–773 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cardaci, S. & Ciriolo, MR Defectos del ciclo TCA y cáncer: cuando el metabolismo sintoniza el estado redox. En t. J. Cell Biol. 2012, e161837 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Pietrak, B. et al. Una historia de dos subunidades: cómo la mutación neomórfica R132H IDH1 mejora la producción de αHG. Bioquímica 50, 4804–4812 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Raineri, S. & Mellor, J. IDH1: Vinculación del metabolismo y la epigenética. Frente. Gineta. 9, 493 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y., Lang, F., Chou, F.-J., Zaghloul, KA y Yang, C. Mutaciones de isocitrato deshidrogenasa en el glioma: genética, bioquímica e indicaciones clínicas. Biomedicinas 8, 294 (2020).

Artículo CAS PubMed Central Google Académico

Roboz, GJ et al. Ivosidenib induce remisiones profundas y duraderas en pacientes con leucemia mieloide aguda con mutación IDH1 recién diagnosticada. Sangre 135, 463–471 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, AX et al. Resultados finales de eficacia de supervivencia general de ivosidenib para pacientes con colangiocarcinoma avanzado con mutación IDH1: el ensayo clínico aleatorizado ClarIDHy de fase 3. JAMA Oncol. 7, 1669-1677 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Intlekofer, AM et al. Resistencia adquirida a la inhibición de IDH a través de mutaciones en la interfaz de dímero trans o cis. Naturaleza 559, 125–129 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choe, S. et al. Mecanismos moleculares que median la recaída después de la monoterapia con ivosidenib en la LMA recidivante o refractaria con mutación IDH1. Sangre Adv. 4, 1894-1905 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oltvai, ZN et al. Evaluación de la resistencia adquirida a la terapia con inhibidores de IDH1 mediante la secuenciación de IDH1 de exón completo y el modelado estructural. Harb de primavera fría. mol. Estudio de caso. 7, a006007 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herold, RA et al. Explotación del nanoconfinamiento de electrodos para investigar las propiedades catalíticas de la isocitrato deshidrogenasa (IDH1) y una variante asociada al cáncer. J. física. química Letón. 12, 6095–6101 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, S. et al. Funciones de los iones metálicos en la inhibición selectiva de variantes oncogénicas de isocitrato deshidrogenasa 1. Commun. Biol. 4, 1243 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rendina, AR et al. El mutante IDH1 aumenta la producción de 2-hidroxiglutarato debido a su mecanismo cinético. Bioquímica 52, 4563–4577 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rose, NR, McDonough, MA, King, ONF, Kawamura, A. & Schofield, CJ Inhibición de las oxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato. química Soc. Rev. 40, 4364–4397 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xie, X. et al. Los inhibidores de IDH1 mutantes alostéricos revelan mecanismos para la selectividad de isoformas y mutantes de IDH1. Estructura 25, 506–513 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Merk, A. et al. Romper las barreras de resolución de Cryo-EM para facilitar el descubrimiento de fármacos. Celda 165, 1698–1707 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okoye-Okafor, UC et al. Nuevos inhibidores mutantes de IDH1 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda. Nat. química Biol. 11, 878–886 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Urbano, DJ et al. Evaluación de los inhibidores de la isocitrato deshidrogenasa mutante mediante un conjunto de ensayos de descubrimiento preclínico. ciencia Rep. 7, 12758 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Machida, Y. et al. Un potente inhibidor de IDH1 mutante permeable a la barrera hematoencefálica suprime el crecimiento de glioblastoma con mutación de IDH1 en un modelo de xenoinjerto ortotópico derivado del paciente. mol. Cáncer Ther. 19, 375–383 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Caravella, JA et al. Diseño basado en la estructura e identificación de FT-2102 (Olutasidenib), un potente inhibidor selectivo de mutantes IDH1. J.Med. química 63, 1612–1623 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Roman, JV, Melkonian, TR, Silvaggi, NR y Moran, GR Análisis de estado transitorio de la isocitrato deshidrogenasa I humana: contabilidad de la interconversión de estados conformacionales activos y no activos. Bioquímica 58, 5366–5380 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zheng, B. et al. Investigación cristalográfica e inhibición selectiva de la isocitrato deshidrogenasa mutante. ACS Med. química Letón. 4, 542–546 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, X. et al. Las estructuras de la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP citosólico humano revelan un nuevo mecanismo de autorregulación de la actividad. J. Biol. química 279, 33946–33957 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ma, R. y Yun, C.-H. Estructuras cristalinas del inhibidor pan-IDH AG-881 en complejo con IDH1 e IDH2 humanos mutantes. Bioquímica Biografía. Res. común 503, 2912–2917 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Levell, JR et al. Optimización de 3-pirimidin-4-il-oxazolidin-2-onas como inhibidores específicos alostéricos y mutantes de IDH1. ACS Med. química Letón. 8, 151–156 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nakagawa, M. et al. La inhibición selectiva de IDH1 mutante por DS-1001b mejora las modificaciones de histonas aberrantes y altera la actividad tumoral en el condrosarcoma. Oncogén 38, 6835–6849 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Forma Therapeutics, Inc. Un estudio abierto, multicéntrico y de fase 1/2 de FT-2102 como agente único y en combinación con azacitidina o citarabina en pacientes con leucemia mieloide aguda o síndrome mielodisplásico con una mutación IDH1. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02719574 (2019).

Forma Therapeutics, Inc. Un estudio de fase 1b/2 de FT 2102 en participantes con tumores sólidos avanzados y gliomas con una mutación IDH1. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03684811 (2020).

Daiichi Sankyo Co., Ltd. Un estudio de fase II de DS-1001b en pacientes con glioma de grado II de la OMS mutado en IDH1 sin quimioterapia ni radioterapia. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04458272 (2020).

Ježek, P. 2-hidroxiglutarato en células cancerosas. antioxidante Señal redox. 33, 903–926 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Reiter-Brennan, C., Semmler, L. & Klein, A. Los efectos del 2-hidroxiglutarato en la tumorigénesis de los gliomas. Contemp. oncol. 22, 215–222 (2018).

CAS Google Académico

Zheng, L., Baumann, U. y Reymond, J.-L. Un protocolo eficiente de mutagénesis dirigida al sitio y de saturación del sitio en un solo paso. Ácidos Nucleicos Res. 32, e115 (2004).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Megarity, CF et al. Voleibol electrocatalítico: ciclo rápido de nicotinamida nanoconfinada para síntesis orgánica en poros de electrodos. Angew. química En t. ed. 58, 4948–4952 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Aguilar, JA, Nilsson, M., Bodenhausen, G. & Morris, GA Espectros de RMN eco de espín sin modulación J. química común 48, 811–813 (2011).

Artículo Google Académico

Winter, G., Lobley, CMC y Prince, SM Toma de decisiones en xia2. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 69, 1260–1273 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCoy, AJ et al. Software cristalográfico Phaser. Aplicación J. cristalogr. 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: construcción de un nuevo software para la determinación automatizada de estructuras cristalográficas. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 58, 1948–1954 (2002).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Focha. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liebschner, D. et al. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 75, 861–877 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Hacia el refinamiento automatizado de la estructura cristalográfica con phenix.refine. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 68, 352–367 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terwilliger, T. SOLVE y RESOLVE: solución de estructura automatizada, modificación de densidad y construcción de modelos. J. Radiación de sincrotrón. 11, 49–52 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Terwilliger, TC et al. Construcción iterativa de modelos, refinamiento de estructuras y modificación de densidad con el asistente PHENIX AutoBuild. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 64, 61–69 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zwart, PH, Grosse-Kunstleve, RW & Adams, PD Xtriage y Fest: evaluación automática de datos de rayos X y estimación del factor de estructura de la subestructura. Noticias de CCP4. 9, 27–35 (2005).

Bardela, C. et al. La expresión de Idh1R132H en el nicho de células madre de la zona subventricular murina recapitula las características de la gliomagénesis temprana. Cancer Cell 30, 578–594 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walsby-Tickle, J. et al. La espectrometría de masas por cromatografía de intercambio aniónico proporciona una amplia cobertura de las vías metabólicas primarias que revelan un metabolismo alterado en las células mutantes IDH1. común Biol. 3, 1–12 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Wellcome Trust (091857/7/10/7), el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/L000121/1, sLoLa Grant BB/J001694/2 y BB/R013829/1), el Consejo de Investigación Médica, el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas y Cancer Research UK (C8717/A18245) por financiar este trabajo. RR recibió el apoyo del Programa de Doctorado en Biología Química Oxford-GSK-Crick a través del DTP Interdisciplinario de Biociencia, BBSRC (BB/R506655/1) y GlaxoSmithKline. ICH agradece a la Fundación para la Educación de Anne Grete Eidsvig y Kjell Inge Røkke por una Beca Aker. PR agradece a la Deutsche Akademie für Naturforscher Leopoldina, Alemania, por una beca postdoctoral. RAH agradece la financiación del Clarendon Fund y una beca Trinity College Birkett. Agradecemos al Dr. Victor Mikhailov por su ayuda con los estudios de EM no desnaturalizante y al Dr. David Staunton por llevar a cabo los experimentos SEC-MALS. Las células HEK293T y los vectores de empaquetamiento lentiviral pMDL, pVSVg y pREV nos fueron proporcionados amablemente por E.Vigna del Candiolo Cancer Institute (IRCCS), Universidad de Turín, Italia. Agradecemos al personal de Diamond Light Source UK por el tiempo de haz y el apoyo en las líneas de luz I03 e I24 (propuesta MX-23459).

james madera & melissa morgan

Dirección actual: Instituto de Genética y Cáncer, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Martín I. Abboud

Dirección actual: Departamento de Ciencias Naturales, Universidad Libanesa Americana, Byblos/Beirut, Líbano

Estos autores contribuyeron igualmente: Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe.

Laboratorio de Investigación Química, Departamento de Química e Instituto Ineos Oxford para la Investigación Antimicrobiana, Universidad de Oxford, 12 Mansfield, Oxford, OX1 3TA, Reino Unido

Raphael Reinbold, Ingvild C. Hvinden, Patrick Rabe, Ian J. Clifton, James SO McCullagh, Martine I. Abboud y Christopher J. Schofield

Departamento de Química, Universidad de Oxford, Oxford, OX1 3QR, Reino Unido

Ryan A. Herold y Fraser A. Armstrong

Instituto de Cáncer y Ciencias Genómicas, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

alina pinzón james madera melissa morgan & chiara bardella

Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Friburgo, 79104, Friburgo, Alemania

Maximiliano Staudt

GlaxoSmithKline, Gunnels Wood Rd, Stevenage, SG1 2NY, Reino Unido

si redmond

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CJS y MIA diseñaron el estudio. RR, MIA y MS produjeron las proteínas. RR realizó ensayos de absorbancia UV, estudios de 1H NMR, CD, estudios DSF y análisis de gel no desnaturalizante. RR y PR realizaron estudios cristalográficos. IJC apoyó el análisis de datos cristalográficos. RR realizó estudios de EM no desnaturalizantes. RAH y FAA realizaron experimentos electroquímicos. AF, JW y MM produjeron y clonaron los vectores mutantes IDH. CB y AF generaron los LV, las células mutantes IDH y realizaron validaciones. ICH y JSOM completaron el tratamiento con inhibidores de las líneas celulares y el análisis metabolómico. JR apoyó experimentos de inhibición. RR y CJS coescribieron el artículo. Todos los autores revisaron el artículo.

Correspondencia a Martine I. Abboud o Christopher J. Schofield.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Christal Sohl y a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Reinbold, R., Hvinden, IC, Rabe, P. et al. La resistencia al inhibidor mutante de la isocitrato deshidrogenasa 1, ivosidenib, se puede superar con inhibidores de unión a la interfaz de dímero alternativos. Nat Comun 13, 4785 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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Recibido: 11 Abril 2022

Aceptado: 25 julio 2022

Publicado: 15 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32436-4

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